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重组蛋白AdipoR1-EGFP真核表达质粒的构建和表达
目的 构建重组pEGFP-N1-AdipoR1真核表达质粒并于HEK293T细胞中瞬时表达.方法 提取HepG2细胞总RNA,逆转录合成cDNA,以其为模板,PCR扩增AdipoR1基因,将其插入到pEGFP-N1质粒中,构建重组真核表达质粒pEGFP-N1-AdipoR1,通过脂质体法转染HEK293T细胞,采用酶标仪测定荧光强度,Western blot方法鉴定融合蛋白AdipoR1-EGFP的表达情况.结果 Western blot结果显示,融合蛋白AdipoR1-EGFP在分子量约70 kD处可见明显的目的条带;同时,与未转染质粒的空白对照组相比,转染pEGFP-N1和pEGFP-N1-AdipoR1的细胞中荧光强度都有明显升高,表明融合蛋白AdipoR1-EGFP在HEK293T细胞中成功表达,并且EGFP的荧光强度测定能很好地反映细胞中融合蛋白的表达水平.结论 构建并表达AdipoR1-EGFP融合蛋白,所采用的EGFP融合蛋白表达方法简单高效,重复性好,为今后AdipoR1蛋白的表达及功能研究提供了重要参考.
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增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达
目的 构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与轮状病毒(RV)VP6基因融合表达载体,研究融合蛋白表达及在细胞中的分布.方法 提取A组人RV TB-Chen株VP6基因,用PCR扩增VP6编码cDNA片段.将此基因片段与真核表达载体pEGFP-C1携带的EGFP融合;运用脂质体的方法,将获得的重组质粒转染到MA104细胞中,在荧光显微镜下观察蛋白的表达及其在细胞中的分布情况.结果 成功构建了融合表达质粒；转染细胞后,融合蛋白可在MA104细胞中表达且主要分布在胞质中.结论 RV VP6可与EGFP融合表达,融合蛋白在细胞质中呈均匀的分布,与RV感染细胞中合成的VP6蛋白的分布有较大的差别.
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甘氨酸和Triton X-100对ZZ-EGFP融合蛋白分泌表达影响的初步研究
目的 考察不同浓度的甘氨酸和Triton X-100对葡萄球菌蛋白质A ZZ亲和肽-增强型绿色荧光蛋白(ZZ-EGFP)融合蛋白在大肠杆菌分泌表达的影响.方法 研究设计为两因素三水平析因设计.向液体培养基中分别加入终浓度0、1%、2%的甘氨酸和0、1%、2%的Triton X-100(共9种组合方式,终浓度均为0者为对照组),诱导大肠杆菌周质腔内ZZ-EGFP融合蛋白泄漏到液体培养基中,以培养上清液荧光强度为观察指标,通过ZZ-EGFP融合蛋白浓度-荧光强度标准曲线快速检测培养基中ZZ-EGFP融合蛋白表达量.结果 培养基中分别加入1%、2%甘氨酸或1%、2%TritonX-100培养后,培养上清液荧光强度分别为 283±11、711±19和622±25、733±25,与对照组(74±5)比较,组间差异均有统计学意义(甘氨酸:F=10.881,P=0.024;Triton X-10:F=12.848,P=0.018);而且甘氨酸与TritonX-100两者之间有交互效应(F=5.441,P=0.005),其中培养基中同时含有终浓度2%甘氨酸及1%Triton X-100时培养上清液荧光强度高(1854±45),ZZ-EGFP融合蛋白分泌表达量达到10.4 mg/L,与对照组(0.94 mg/L)相比提高了11倍.结论 甘氨酸和Triton X-100能提高ZZ-EGFP融合蛋白在液体培养基中的分泌表达量.
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荧光标记肿瘤转移体内模型的建立
目的 建立一种带荧光标记的肿瘤转移模型并探讨其应用价值.方法 人胃癌MGC-803细胞和小鼠宫颈癌U14细胞进行体外传代培养,转染pEGFP-N1质粒,24h检测转染效率,用无限稀释法筛选稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的单克隆细胞株MGC-803-GFP和U14-GFP.分别体内移植于BALB/c-nn裸鼠和C57BL/6J小鼠,观察成瘤潜伏期,绘制体内生长曲线,利用活体荧光成像系统活体连续观察GFP在体内的表达,观察肺部和淋巴结的转移情况,计算转移率.免疫组织化学检测与转移相关的分子CD44和E-cadherin在移植瘤中的表达.结果 MGC-803细胞和U14细胞pEGFP-N1转染24 h后的转染效率分别为30%和60%.获得了GFP(+)的单克隆MGC-803-GFP细胞株和U14-GFP细胞株.MGC-803-GFP在BALB/c-nu裸鼠和U14-GFP在C57BL/6J小鼠移植成瘤的潜伏期分别是3～5 d和2～4 d,成瘤率均为100%.利用活体荧光成像系统连续观察,可以清楚直观地观察表达GFP的MGC-803-GFP移植瘤在体内的生长,接种后第60天处死全部荷瘤鼠,解剖后仅有1只可见同侧腋窝下淋巴结的转移.接种U14-GFP后,分别在第28、37和52天观察了荷瘤小鼠肿瘤转移的发展过程.在U14-GFP原发瘤体积达到≥5 cm3时,肺部和淋巴结转移率分别为67%和100%.在MGC-803-GFP和U14-GFP的移植瘤中都可以检测到CD44的表达,而无E-cadherin的表达.结论 成功建立了表达绿色荧光蛋白单克隆细胞株MGC-803-GFP和U14-GFP,体内移植建立了荧光标记的肿瘤转移模型.该模型可用于可视化肿瘤体内的研究.
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肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1核仁定位信号序列的鉴定
目的 鉴定肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1蛋白中潜在的特异性定位信号序列并探索其亚细胞定位机制.方法 聚合酶链反应(PCR)扩增TMSG-1开放读码框全长及不同长度的截断片段,定向克隆于绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒pEGFP-N1;各融合蛋白表达质粒转染人胚肾细胞系HEK293细胞；转染48 h后提取细胞总蛋白进行GFP的Western blot检测或用冷丙酮固定细胞后激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位.结果 GFP分别融合TMSG-1全长蛋白(aa1-380)及其截断片段T1(aa1-70)、T2(aa1-128)、T3(aa129-380)、T4(aa71-128)、T5(aa71-179)和T6(aa71-380),Western blot检测结果显示成功表达了各融合蛋白.激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位显示融合蛋白T4(aa71-128)主要定位于细胞核内的核仁部位,融合蛋白T6(aa71-380)以细胞核内弥散分布为主,而TMSG-1全长融合蛋白及融合蛋白T1、T2、T3、T5则定位于胞质.进一步的序列缺失去除T4( aa71-128)羧基末端10个氨基酸得到截断片段T4Δ119-128,T4Δ119-128融合的GFP仍位于细胞核,但核仁内的绿色荧光信号明显减弱.结论 肿瘤转移抑制相关基因TMSG-1存在潜在的核仁定位信号,位于aa119-128(RRRRNQDRPS),这一发现为深入研究TMSG-1的亚细胞定位及相关功能奠定了基础.
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利用Psm22α-EGFP-1质粒重组体从小鼠间充质干细胞中分选平滑肌祖细胞
目的 为了从骨髓间充质干细胞中分离纯化出平滑肌祖细胞,探讨骨髓来源的平滑肌祖细胞(SMPC)向平滑肌方向分化的机制和特点.方法 构建了含有sm22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒重组体后用脂质体转染的方法,将Psm22α-EGFP-1重组体转入体外原代培养一周的小鼠间充质干细胞中.在转染后的3、5、7、10 d分别观察平滑肌特异性蛋白sm22α启动子控制下绿色荧光蛋白表达量的变化和转入重组体后间充质细胞形态的变化,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法观测转染后的骨髓间充质干细胞中myocardin mRNA表达水平的变化,并以免疫荧光法检测转染后第5天骨髓间充质干细胞CD34的表达.结果 转入Psm22α-EGFP-1重组体后的第3天,在荧光显微镜下观察到有绿色荧光蛋白表达的细胞.此后随着时间的推移,表达绿色荧光蛋白的细胞数目持续增加,在第7天时达到高峰,以后逐渐减弱.在不同时间点的绿色荧光蛋白阳性细胞百分率分别为:3 d:7%±0.13%,5 d:10%±0.32%,7 d:20%±0.26%,10 d:12%±0.18%,t=3.45,P＜0.05.在相应的时间点的转染后的骨髓间充质干细胞,myocardin mRNA表达变化的趋势与绿色荧光表达的变化趋势大致相符.阳性对照组的脂质体的转染效率每个组均控制在70%±1.5%(P＞0.05).在激光共聚焦显微镜下观察可见,发绿色荧光的细胞形态呈多态性,动态观察发现绿色荧光蛋白的分布趋势是从胞核逐步分布至胞质.免疫荧光显示在转染后第5天的细胞中CD34的阳性率为5.2%±0.21%(P＞0.05).结论 在小鼠的骨髓间充质干细胞中存在着具有向平滑肌细胞方向分化潜能的祖细胞,即所谓的平滑肌祖细胞.利用Psm22α-EGFP-1质粒重组体可以从小鼠间充质干细胞中分选出平滑肌祖细胞.
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增强型绿色荧光蛋白转染猪骨髓间充质干细胞特性观察
目的:借助质粒将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染猪骨髓干细胞(MSC),观察转染后EGFP在(MSC)内表达情况及MSC生长特性.方法:1月龄小型香猪为MSC供体,EGFP基因转染MSC,计算转染效率,流式细胞仪鉴定G418筛选后EGFP基因稳定表达率和转染后细胞增殖周期改变.结果:转染率为(36.9±3.4)%;G418筛选后EGFP表达率75.6%,EGFP转染MSC G0/G1期MSC比例较对照组明显增加(P<0.01),S+G2/M期MSC比例减少(P<0.01).结论:猪MSC经基因转染和G418筛选,获得EGFP稳定表达;转染和G418筛选后MSC增殖能力降低,G0/G1期MSC比例增加,S+G2/M期MSC比例下降.
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人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能.方法 以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶Not Ⅰ和Nsi Ⅰ酶切、T4 DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度.病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒；浓缩假病毒后测定其滴度为2×109 TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70％以上.PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2C mRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(=11.93,P=0.000).结论 成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础.
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携带人肝细胞生长因子腺病毒重组体的构建
目的 构建一种同时携带人肝细胞生长因子(hHGF)及绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒重组体,为hHGF的基因治疗提供实验基础.方法 对重组质粒pcDNA3-hHGF进行酶切鉴定及测序正确后,酶切获得hHGF,亚克隆至带有GFP 标记的穿梭质粒pAdTrack-CMV上.选取hHGF 正向插入的重组穿梭质粒经PmeⅠ充分线性化后,与骨架质粒pAdEasy-1 在大肠杆菌BJ5183 中同源重组,挑取阳性克隆行PCR 及酶切鉴定.重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后,脂质体转染HEK293 细胞进行包装并扩增获取重组病毒上清,RT-PCR 及Western Blot 方法检测hHGF 的表达.结果 目的基因的测序结果与Genebank上的hHGF序列一致.hHGF 基因插入重组腺病毒载体的预期位置,感染Ad-hHGF的HEK293细胞中可检测到hHGF mRNA 和蛋白的表达.结论 成功构建了同时携带hHGF和GFP的重组腺病毒表达载体Ad-hHGF,为进一步探讨hHGF 的生物学功能提供了实验依据.
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增强型绿色荧光蛋白示踪人膀胱癌细胞裸鼠膀胱腔内种植转移的观察
目的 建立能够准确评估成瘤、可视的膀胱癌腔内种植转移动物模型.方法 利用前期获得的具有高侵袭力和稳定高表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的单克隆细胞株,培养后通过膀胱插管的方法灌注裸小鼠膀胱(共20只裸鼠).饲养后于2h、24 h、7d、2周、3周和4周时(每个时间点随机取2只裸小鼠),通过体视荧光镜观察成瘤情况.体视荧光镜检测完毕后处死裸鼠,无菌条件下取出膀胱,PBS冲洗,并剪碎,胰蛋白酶重悬,摇床上37℃振荡过夜,流式细胞仪检测EGFP表达量.结果 灌注膀胱肿瘤细胞2h和24 h后的整体荧光成像系统图像,未见肿瘤生成,7d开始有肿瘤逐渐出现,并逐渐增大,到4周时整体荧光成像系统下肿瘤占据膀胱的大部分,并且发出很强的荧光.流式细胞仪检测发现灌注膀胱肿瘤细胞2h、24 h后,可检测到的RGFP表达量较少,并且有下降趋势;1周之后开始逐渐增加,到4周时达EGFP的细胞比例为62.3％和58.4％.结论 该模型具有成瘤率高,可以在不处死裸鼠的情况下体外、动态观察肿瘤的生长;通过流式细胞仪可以对成瘤情况进行精确评估.其可为膀胱癌腔内种植转移机制的研究提供条件,也为评价和筛选抗膀胱肿瘤药物提供了较为理想的动物模型.
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GFP-LC3真核表达载体构建、定位及胶质瘤U87稳定转染细胞系筛选
目的：构建GFP-LC3真核表达载体，验证其在胶质瘤U87细胞系中对细胞自噬现象的指示作用，并获得稳定转染该载体的U87细胞。方法以人外周血cDNA为模板扩增全长LC3基因，通过分子生物学操作将其导入 pcDNA3-GFP 中，得到重组质粒 pcDNA3-GFP-LC3。将重组及对照质粒转染胶质瘤U87细胞系，雷帕霉素（Rapamycin）处理48 h后用Western blot方法检测细胞中自噬相关蛋白表达变化，荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达及Rapamycin处理后细胞的自噬情况。并利用G418筛选，获得稳定表达GFP-LC3的U87细胞系。结果成功构建pcDNA3-GFP-LC3真核表达载体，该载体能在胶质瘤U87细胞系中表达，荧光显微镜下可见绿色荧光。自噬诱导剂 Rapamycin 处理后，该载体可以很好地指示细胞中自噬泡的形成过程。成功获得稳定转染GFP-LC3载体的U87细胞系。结论 pcDNA3-GFP-LC3真核表达载体及稳定转染胶质瘤U87细胞系为研究胶质瘤细胞的自噬及抗肿瘤药物对胶质瘤细胞自噬的影响提供了简洁而有效的工具。
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慢病毒载体介导 GFP 基因转染犬脂肪干细胞的实验研究
目的研究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白（GFP）转染犬脂肪干细胞（ADSCs）的理想条件，检测转染后细胞的生物学特性及分化能力。方法酶消化法获取ADSCs ，流式细胞技术检测细胞表面抗原，慢病毒载体介导GFP以50、100、150和200的感染复数（ MOI）作用24 h转染ADSCs，荧光显微镜及流式细胞检测荧光强度和转染效率，CCK-8法检测转染对ADSCs生长和增殖的影响，将转染ADSCs经成肌诱导后，免疫荧光检测成肌细胞特异性抗原结蛋白（desmin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达情况。结果流式细胞仪检测结果CD90、CD44、CD105表达均为阳性，CD34、CD45表达均为阴性，MOI为50、100、150和200，转染效率分别为75.88％、90.99％、97.42％和99.17％。 MOI为150时，转染对ADSCs增殖无明显影响。病毒转染ADSCs经成肌诱导分化后，表达desmin和α-SMA阳性。结论慢病毒载体介导的GFP能高效标记ADSCs，且标记后细胞的增殖分化能力无明显影响。
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携带增强绿色荧光蛋白基因慢病毒载体标记兔滑膜间充质干细胞
目的：通过对携带增强绿色荧光蛋白（enhanced-green fluorescent protein，eGFP）基因的慢病毒载体系统的构建，感染兔滑膜间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSC），以获得稳定表达GFP的兔SMSC。方法在体外分离培养、纯化兔SMSC，通过Lipofectamine2000转染法将第三代慢病毒载体四质粒共转染293FT细胞产生慢病毒，收集、浓缩后进行滴度测定，对培养好的兔SMSC进行慢病毒感染，在荧光显微镜下观察GFP基因表达情况。结果第三代慢病毒四载体转染293FT细胞72 h可见到很强的GFP表达，收集、浓缩后测得病毒滴度为4.0×108 TU/ml，感染48 h后在荧光显微镜下可见约90%的兔SMSC标记上GFP基因。结论通过Lipofectamine2000转染法成功构建了第三代慢病毒高效率载体系统，且对兔SMSC感染效果良好，为以后兔SMSC的体内示踪标记奠定了基础。
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转增强型绿色荧光蛋白的脐血干细胞制备嵌合体小鼠的研究
目的：本研究通过囊胚腔显微注射转增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的脐血干细胞的方法制备嵌合体小鼠，以期为研究成体干细胞的体内分化提供一定的实验依据和理论基础。方法分离得到的表达绿色荧光的小鼠脐血干细胞用于囊胚腔显微注射。然后进行胚胎移植，出生的嵌合体小鼠首先进行毛色嵌合的观察，再对各组织进行基因组DNA和RNA水平的检测。流式细胞术检测阳性小鼠的组织中绿色荧光细胞的百分率。结果分离出的脐血干细胞，经流式检测表达绿色荧光的细胞所占的比例为80.25%。经显微注射和胚胎移植，共出生5只小鼠，均为白色，没有发生毛色嵌合。分别取心肌、肝、肺、皮肤、腿肌和脂肪共6种组织对EGFP基因进行PCR和RT-PCR检测。结果显示，有2只小鼠的腿肌和脂肪组织显示阳性，其他组织和其他3只小鼠的6种组织均为阴性。将这2只小鼠的腿肌和脂肪组织消化成单细胞悬液，进行流式细胞分析。结果显示2只嵌合小鼠腿肌和脂肪组织的平均嵌合率分别为9.87%和5.78%。结论来自成体的脐血干细胞在体内可以分化成腿部肌肉和脂肪组织的细胞。
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肌细胞增强因子2A CAG重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性研究
目的 构建肌细胞增强因子2A(MEF2A)/绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体,检测其在Hela和293T细胞中的表达,探讨MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变与其细胞学定位功能的相关性.方法 用PCR法扩增野生型MEF2A基因全长eDNA序列,以及其他含4～15个CAG三联核苷酸重复序列的变异型MEF2A全长cDNA序列,将上述12种MEF2A全长cDNA序列分别克隆入带有GFP报告基因的真核表达载体pEGFP-C1,构建MEF2A野生型融合表达质粒pEGFP-MEF2A、变异型融合表达质粒pEGFP-MEF2A-CAGr;通过脂质体介导的方法将以上质粒转染到Hela和293T细胞,荧光显微镜检测GFP蛋白的表达.结果 构建成功与GFP融合的野生型及变异型MEF2A蛋白表达质粒共12种用于细胞学定位功能研究,体外实验结果显示,上述12种MEF2A蛋白均定位于细胞核内.结论 MEF2A第11号外显子CAG三联核苷酸重复序列的改变不会影响其细胞内的定位功能.
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外周血间充质干细胞移植防治兔血管成形术后再狭窄的探讨
目的 探讨外周血间充质干细胞(MSCs)移植时模型免颈动脉血管成形术后再狭窄的防治作用.方法 新西兰大白兔65只,5只作为产生MSCs的种兔,60只随机分为MSCs移植组和对照组,每组30只,术后7、14、28天处死兔,取颈动脉血管标本通过weigert弹力纤维染色及免疫组织化学染色进行形态学分析、内皮化程度分析、归巢MSCs的鉴定和分化跟踪等.结果 MSCs移植组术后7、14、28天内膜面积、内膜面积/中膜面积及再狭窄率明显低于对照组(P<0.01);内皮化程度分析显示,MSCs移植组明显优于对照组(P<0.01).MSCs移植组术后7、14、28天血管组织中有绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞分布,且部分细胞同时为GFP和CD31阳性,但在未损伤血管及对照组则无.结论 静脉移植外周血MSCs能促进模型兔颈动脉球囊成形术后损伤血管的快速内皮化,抑制内膜增生和减少术后再狭窄;这一有益作用可能与MSCs归巢到损伤血管局部并部分分化为内皮细胞有关.
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重组1和2型腺相关病毒载体在小鼠心脏转导研究
目的 探讨重组1和2型腺相关病毒(rAAV1和rAAV2)载体向小鼠心脏转导效果.方法 14只昆明小鼠应用经腹心包腔内注射术,分别将携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)、荧光素酶(LUC)报告基因的rAAV1(rAAV1-EGFP组6只,rAAV1-LUC组1只)、rAAV2(rAAV2-EGFP组6只,rAAV2-LUC组1只)分别转导入小鼠的心包腔内,使用共聚焦显微镜观察EGFP在心肌的表达,冷光CCD相机体内监测LUC在心肌表达.结果 rAAV1-EGFP组绿色荧光出现于心肌组织全层;rAAV2-EGFP组绿色荧光仅局限于心外膜下少数心肌细胞.rAAV1-EGFP组小鼠心肌细胞的表达范围和强度优于rAAV2-EGFP组.rAAV1-LUC组小鼠心肌组织表达强度、持续表达时间优于rAAV2-LUC组.结论 在小鼠心脏中,rAAV1是一种比rAAV2更为有效的转基因载体.
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绿色荧光蛋白标记人脐带间充质干细胞兔耳移植的实验观察
目的：观察人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）移植于兔耳后不同时间存活的情况，为hUC-MSCs 参与动物实验提供实验依据。方法以腺病毒介导绿色荧光蛋白（ GFP）基因体外转染hUC-MSCs 48 h，于兔耳皮下注射移植，于注射移植后即刻及移植后3、7、14、21 d 取材并在荧光显微镜下观察 hUC-MSCs 的存活情况。注射移植后3 d 取材石蜡切片行苏木精-伊红（HE）染色观察移植细胞部位组织病理图像。结果 hUC-MSCs 注射移植后3 d、7 d 时 GFP 荧光表达较强，细胞轮廓清晰，与注射后即刻平均吸光度值比较，移植后3、7 d 检测荧光吸光度值差异均无统计学意义（ P >0.05）；移植后14 d、21 d 时 GFP 荧光表达较弱，吸光度值差异有统计学意义（ P <0.05）。术后3 d hUC-MSCs 移植区域兔耳组织切片光镜下移植 hUC-MSCs 细胞清晰可见，无急性排斥反应特征出现。结论 hUC-MSCs 至少能够在1周时间内较好存活于兔耳皮下，其与异种个体组织相容性较好。
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CHO细胞株中高危型HPV-16E6与低危型HPV-11E6的定位分析
目的:探讨高危型HPV-16E6与低危型HPV-11E6生物学行为的差异.方法:构建真核表达载体pGFP-16E6和pGFP-11E6,转染CHO细胞,荧光显微镜下动态观察E6蛋白的定位和表达水平.结果:CHO细胞在转染pGFP质粒后的21 h,GFP表达到达高峰,高危型GFP-16E6主要定位于细胞核内,低危型GFP-11E6主要定位于:细胞质内,与GFP均匀分布于整个细胞明显不同;自转染后6 h,GFP和GFP-16E6蛋白开始表达(荧光强度为54.12和48.27),而GFP-11E6蛋白在转染后的12 h才开始表达(85.64),至21 h时,GFP、GFP-16E6和GFP-11E6蛋白的表达均达到高峰(132.19、121.94和127.91),P＜0.05;以后,随时间的延长蛋白表达逐渐降低.结论:HPV-16E6主要定位于细胞核,HPV-11E6主要定位于细胞质,这或许可以成为它们致病性差异的一种解释.
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表达绿色荧光蛋白的单纯疱疹病毒检测循环肿瘤细胞
目的 以表达绿色荧光蛋白(GFP)的单纯疱疹病毒(HSVGFP)建立一种快速检测循环肿瘤细胞(CTCs)的方法,并与常规细胞学检测方法的检测结果进行比较.方法 将HSVGFP与7个不同的肿瘤细胞系共培养,用荧光显微镜观察表达荧光的细胞.将10、100、1000和10000个人肺癌PG细胞加入到2ml全血中,以淋巴细胞分离液清除红细胞,同时富集肿瘤细胞.以HSVGFP感染收集到的细胞,用荧光显微镜确定荧光细胞数量,分析HSVGFP检测方法的敏感性.以HSVGFP法检测70例肿瘤患者临床样本中的CSCs,并与其中15例有细胞学报告者的检测结果进行比较.结果 HSVGFP感染的7个肿瘤细胞系均表达绿色荧光.应用HSVGFP检测方法,可以在仅加入了10个肿瘤细胞的2 ml全血中检测出阳性结果.对70例临床样本采用HSVGFP法进行检测的结果显示,有40例样本呈阳性反应.在15例有细胞学检测结果的临床样本中,细胞学检测阳性仅有4例,而HSVGFP方法检测阳性有11例;其中细胞学检测阳性的4例样本,HSVGFP检测均为阳性.结论 以HSVGFP检测患者体内CTCs的方法简便,且具有较高的敏感性.
