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哺乳动物细胞西尼罗病毒样颗粒表达、纯化及其鉴定
目的 利用哺乳动物细胞表达含有西尼罗病毒(W NV) prM和E蛋白,形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),为西尼罗病毒感染的免疫诊断试剂的研制奠定基础.方法 筛选典型西尼罗病毒株,构建重组质粒,转染293T细胞,表达并纯化西尼罗病毒prM-E蛋白,利用透射电镜、免疫印迹试验、间接免疫荧光实验(IFA)和酶链免疫吸附试验(ELISA)对表达产物进行鉴定.结果 重组质粒转染细胞后产生病毒样颗粒(virus like particles VLPs),转染细胞上清纯化物中透射电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的病毒样颗粒蛋白能够与抗西尼罗病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性;间接ELISA证实,重组蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体.结论 在哺乳动物细胞中表达的西尼罗病毒样颗粒具有良好的抗原性,为西尼罗病毒感染快速特异诊断试剂研制奠定了基础.
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IK6过表达慢病毒载体的构建及其在THP1细胞系中的表达和生物学特征
本研究旨在构建人IK6基因过表达的慢病毒载体,观察其在THP1细胞株中的表达及对其生物学特征的影响,为研究该基因在白血病中的作用提供基础.采用RT-PCR方法获得目的基因,并与线性化慢病毒载体pGC-FU重组构建慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP,通过菌落PCR鉴定、测序比对分析,确定克隆的正确性.使用Lipofectamine 2000,将慢病毒载体pGC-FU-IK6-GFP转染293T细胞,测定病毒滴度后转染THP1细胞株,用流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR检测靶细胞内IK6 mRNA表达,Western blot检测IK6-GFP融合蛋白,进一步观察THP1生物学特征的改变.结果表明,利用RT-PCR方法获得IK6目的基因并连接到线性化的慢病毒载体上,成功构建具有Amp抗性的pGC-FU-IK6-GFP质粒并转染293T细胞,获得滴度为2.0×109TU/ml的病毒.用目的质粒转染THP1细胞,转染效率可达90％.在靶细胞中检测到IK6 mRNA表达和IK6-GFP融合蛋白表达.IK6能够促进靶细胞克隆形成并且具有抑制凋亡的作用,而对细胞周期无显著影响.结论:成功构建IK6过表达的慢病毒载体,使IK6在THP1细胞株中稳定表达.对靶细胞生物学研究发现IK6极为可能干扰了正常Ikaros蛋白的抑癌作用,并存在潜在的抗凋亡作用,进而在一定程度上促进白血病细胞生长,但对细胞周期无明显影响.该研究为进一步探讨IK6在急性髓系白血病的作用奠定了基础.
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IGFBP7基因慢病毒载体的构建及在K562细胞中的表达
本研究构建胰岛素样生长因子结合蛋白7( IGFBP7)基因的慢病毒载体,为研究该基因在白血病中的作用提供基础.采用限制性内切酶酶切获得目的基因,基因重组构建慢病毒载体质粒venus-IGFBP7,用293T细胞包装慢病毒颗粒,感染K562细胞,并采用多种方法鉴定.结果表明,所获IGFBP7基因经测序与GenBank比对序列一致,慢病毒载体质粒venus-IGFBP7经BamH Ⅰ酶切鉴定片段大小正确,荧光显微镜及流式细胞术检测到绿色荧光蛋白在293T及K562细胞中表达,RT-PCR和Western blot检测到IGFBP7 mRNA和蛋白在K562细胞表达.结论:成功构建带有IGFBP7基因的慢病毒载体,为研究IGFBP7基因在K562细胞中的作用奠定了基础.
关键词： 胰岛素样生长因子结合蛋白7基因 慢病毒载体 293T细胞 K562细胞 -
293T细胞模型中整合素β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响
目的:建立含有Calpain切割相关的β3胞浆尾段突变体的293T细胞模型,研究β3胞浆尾段不同氨基酸基序对αⅡbβ 3介导的细胞功能的影响.方法:利用293T细胞模型建立共表达人类野生型整合素αⅡb和野生型β3或突变型β3(β3△NITY(β3胞浆段截去NITY基序)、β3△754(β3胞浆段截去羧基末端后8个氨基酸TNITYRGT)、β3△759(β3胞浆段截去羧基末端后3个氨基酸RGT)的稳转细胞株,通过细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展试验检测各稳转细胞株的黏附及伸展功能.结果:成功建立了293T-αⅡbβ3△NITY、293T-αⅡbβ3△754、293T-αⅡbβ3△759、293T-αⅡbβ3细胞株,稳定表达野生型整合素β3全长的293T-αⅡb β3细胞株较293T细胞具有良好的在固相化纤维蛋白原上的黏附和伸展能力,可以作为血小板的替代模型,而293T-αⅡbβ3△NITY稳转细胞株的黏附和伸展能力稍低于293T-αⅡbβ3稳转细胞株,但293T-αⅡbβ3△754细胞、293T-αⅡbβ3△759细胞株的黏附和伸展能力均明显受损.结论:对整合素β3介导的细胞伸展功能,RGT基序至关重要,而NITY并非必不可少,同时所建β3胞浆尾段不同突变体的293T细胞株也为进一步的质谱分析数据库比对奠定了基础.
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变形链球菌表面蛋白可变区真核载体质粒pEGFP-N1一SrV+的构建及在293T细胞的表达
目的 构建变形链球菌(变链菌)表面蛋白可变区(extended-v)真核表达质粒pEGFP-NI-SrV+,并转染哺乳动物细胞293T,为进一步研究该区功能奠定基础.方法 根据已报道变链菌OMZ175的sry+基因序列,化学合成srV+的编码基因srv+,将真核载体质粒pEGFP-N1和srv+基因片段分别用Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切,连接获取重组质粒pEGFP-NI-SrV+,并对其进行PCR、酶切和测序鉴定.通过脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞293T.运用荧光显微镜观察、Western blot及real-time PCR法检目的 蛋白在293T细胞中的表达情况.结果 通过基凶化学合成技术,获得1136 bp的目的 基因srv+,经测序鉴定与模板目的 基因序列一致;成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV+;PCR扩增榆测可获得1.33 kb目的 基因片段;Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切可见4.7 kb和1.1 kb两条电泳条带,证实重组质粒pEGFP-N1-SrV+携带目的 基因;通过荧光显微镜观察到重组质粒pEGFP-N1-SrV+融合GFP后的表达,目的 细胞的转染效率达到80%以上;Western blot检测到相对分子质量(M1)为72 × 103处有特征条带,其大小和Srv+融合蛋白(42 × 103+28 × 103=70 × 103)相吻合;real-time PCR 数值分析显示:在293T细胞中,srv+基因的过表达效果显著.结论 成功构建了真核表达载体质粒pEGFP-N1-SrV+,并能够在哺乳动物细胞293T中表达.
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人肌细胞增强因子2C基因慢病毒载体的构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建人肌细胞增强因子2C(MEF2C)慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究MEF2C的功能.方法 以人MEF2C基因序列为模板合成其编码框序列,通过限制性内切酶Not Ⅰ和Nsi Ⅰ酶切、T4 DNA连接酶连接,将MEF2C插入慢病毒载体质粒LV5-GFP,构建人MEF2C基因重组慢病毒质粒载体,转化感受态细菌,筛选阳性克隆,与包装质粒通过脂质体共转染人胚肾细胞系293T,进行慢病毒包装并测定病毒滴度.病毒感染293T细胞,荧光显微镜下观察感染效率,PCR方法检测MEF2C mRNA的过表达情况.结果 成功构建慢病毒表达载体LV5-MEF2C-GFP,三质粒共转染293T细胞后形成假慢病毒颗粒；浓缩假病毒后测定其滴度为2×109 TU/ml;以复感染系数MOI为5感染293T细胞,感染效率在70％以上.PCR证实感染带有目的基因假病毒的293T细胞表达MEF2C mRNA的水平较感染阴性对照病毒的293T细胞表达水平明显升高(=11.93,P=0.000).结论 成功构建MEF2C慢病毒表达系统,为应用过表达技术探索其在肿瘤发生和发展中的作用奠定了基础.
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人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达
目的构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的蛋白.方法人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的DNA,用限制性内切酶Sal I和BamH I分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.
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人胸腺素β4RNA干扰载体的构建及其对293T细胞目的基因表达的影响
目的 探讨人胸腺素β4(thymosin β4,TMSB4)基因RNA干扰慢病毒载体的构建,观察病毒感染293T细胞后TMSB4 mRNA和蛋白表达,为进一步研究TMSB4基因的功能提供基础.方法 设计特异性干扰人TMSB4基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNA oligo,与经Age I和EcoR I双酶切后的pGCSIL-GFP载体连接产生慢病毒载体.转化感受态大肠杆菌DH5a并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定.慢病毒载体、包装系统质粒共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度.将获得的慢病毒感染293T细胞,分别采用实时定量PCR和免疫细胞化学染色方法 观察 TMSB4mRNA和蛋白的表达情况,利用生成的 TMSB4 shRNA慢病毒感染原代成纤维细胞.结果 感染重组慢病毒的293T细胞与空病毒转染阴性对照细胞的TMSB4 mRNA表达分别为0.56±0.11和1.00±0.06(P=0.0006),实验组细胞的敲减率为44%.实验组TMSB4蛋白表达水平0.042±0.007比阴性对照组细胞0.093±0.009的表达降低55%(H=461.342,P<0.001).感染重组慢病毒的原代培养的成纤维细胞与空病毒转染的对照细胞相比,TMSB4蛋白表达水平亦明显降低.结论 TMSB4基因干扰慢病毒构建成功并能显著降低TMSB4基因和蛋白在293T细胞中的表达,成功感染原代成纤维细胞使其目的 基因蛋白减少,为进一步研究TMSB4基因的功能奠定研究基础.
关键词： Thymosin β4 293T细胞 RNA干扰 慢病毒 -
不同类型载体携带Math1-EGFP基因对293T细胞转染效率及细胞毒性的研究
目的 比较腺病毒、脂质体、纳米材料三种不同类型的载体携带目的 基因对293T细胞的转染效率及细胞毒性的大小,筛选理想的基因载体.方法 用重组腺病毒、Lipofectamine~(TM) 2000、Entranster~(TM)-D纳米材料为转染载体,携带含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的Math1-EGFP基因及真核表达质粒pRK5-Math1-EGFP,按照转染试剂盒说明优化其转染条件,分别转染293T细胞.24小时后在共聚焦显微镜下观察转染结果 并计数阳性细胞率,采用RT-PCR法检测转染细胞中Math1基因mRNA的表达,用MTT法检测不同转染条件下,不同转染载体对293T细胞的细胞毒性.结果 经优化转染条件,重组腺病毒载体转导的细胞中荧光蛋白表达几乎为95%以上,Lipofectamine~(TM) 2000、Entranster~(TM)-D纳米材料载体转染的细胞中荧光蛋白表达也分别达到70%和80%以上,而Entranste~(rTM)_-D纳米材料载体在高转染效率的剂量下仍然保持80%以上的细胞生存率.RT-PCR进一步证实,三种载体转染细胞均有Math1基因mRNA的表达.结论 Entranster~(TM)-D纳米载体作为一种新型纳米聚合物转染试剂,能成功携带内耳基因治疗关键基因Math1基因转染293T细胞,并表现了低毒、高效性能.
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人G250真核表达载体pIRES-neo-G250的构建及表达
目的 构建包含人的G250真核表达载体,并将该载体转导入293 T细胞检测其表达,为构建以G250为靶点的肾癌模型提供研究基础.方法 通过聚合酶链反应获得G250基因,将其连接至PMD18T过渡载体,然后克隆到载体pIRES-neo中.把构建后的重组质粒pIRES-neo-G250转染到293 T细胞,用流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测其表达.结果 PCR扩增出的G250基因测序正确,酶切鉴定重组质粒pIRES-neo-G250正确,说明质粒构建成功;流式细胞术、免疫荧光和RT-PCT检测结果表明,重组质粒pIRES-neo-G250在293 T细胞中得到表达.结论 该实验成功构建了重组质粒pIRES-neo-G250,并且在293T细胞中能够有效表达,为后续构建转染人G250的基因细胞株工作奠定了基础.
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Sirt3介导的SOD2在电离辐射中的作用研究
目的 观察293T细胞经不同剂量137Cs γ射线照射后,细胞中沉默信息调节因子3(sirt3)及相关抗氧化因子的变化,研究sirt3基因在辐射防护中的抗氧化活性机理.方法 采用137Cs对293T细胞分别进行2、4、8和16 Gy照射,采用Real-Time PCR的方法,检测照后6、12、24和48 h,细胞中sirt3和超氧化物歧化酶2(SOD2) mRNA的表达水平变化;采用免疫印迹法,检测细胞中sirt3和SOD2蛋白水平随时间的变化;采用siRNA干扰和抑制剂处理的方法,检测sirt3与SOD2的作用关系;采用SOD Assay Kit-WST试剂盒检测细胞中SOD2酶活力的变化;流式细胞术检测细胞中活性氧(ROS)随时间的变化.结果 各组细胞中sirt3和SOD2的mRNA水平和蛋白质水平均表现出不同程度的上升,与0 Gy组比较,分别在12 h(t =6.75、13.59、6.59、10.13,P＜0.05)和24 h(t=6.80、8.73、11.09,P＜0.05)达到大值;sirt3 siRNA干扰和抑制剂处理结果显示sirt3是SOD2的上游调控因子;照射24 h后细胞中SOD2的活性显著增加,与0 Gy组比较,差异有统计学意义(t =46.04、23.19、26.28、14.70,P＜0.05),细胞中ROS水平也发生相应变化.结论 sirt3可能通过对细胞中SOD2的表达量及活性的调控加强抗氧化保护系统,为临床辐射防护和治疗提供实验依据.
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人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达
目的 构建含有FLAG标签的人DC-SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达.方法 通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC-SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES-neo中.构建的重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及Western Blot检测其表达情况.结果 含FLAG标签的人DC-SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG-DC-SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES-neo中;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN在293T细胞中得到表达.结论 成功构建了重组质粒pIRES-neo-FLAG-DC-SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础.
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人PSCA真核表达载体的构建及表达
目的 构建含有信号肽及FLAG标签的人前列腺干细胞抗原(PSCA)真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达.方法 通过PCR方法获得SIG-FLAG基因片段及人PSCA基因片段,插入到真核表达载体pIRES-neo中.构建的重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及RT-PCR方法检测其表达情况.结果 PCR扩增出的SIG-FLAG及PSCA基因测序正确,酶切鉴定证明重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA构建成功;检测结果显示重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA在293T细胞中得到表达.结论 成功构建了重组质粒pIRES-neo-sig-FLAG-PSCA.且在293T细胞中能有效表达,为后续转人PSCA基因细胞系的构建工作奠定了基础.
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慢病毒Lenti-CXCR4-siRNA载体的构建
目的 构建介导CXCR4 RNA干扰的Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒载体.方法 将人工合成的CXCR4siRNA经PCR扩增聚合后与线化的载体GV115连接,Xhol酶切及测序鉴定该表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA,按Lenti-X Bicistronic Expression System操作手册构建Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒,纯化后测定其滴度.结果 凝胶电泳显示PCR扩增聚合产物大小正确(约60 bp).表达质粒pLenti-CXCR4-siRNA可被Xhol内切酶线化.碱基测序证实碱基序列与设计序列一致.重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒的包装细胞293T可见绿色荧光,纯化后测定其滴度,病毒滴度为2×109TU/ml.结论 成功构建了高滴度的重组Lenti-CXCR4-siRNA慢病毒.
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小鼠甲基转移酶EZH2基因慢病毒表达载体的构建及验证
目的 构建小鼠组蛋白H3 K27三甲基转移酶EZH2基因慢病毒载体及鉴定.方法 以携带EZH2 cDNA的PCMV-SPORT6载体为模板,自行设计携带有Kpnl和Xmal酶切位点的引物PCR扩增出目的基因编码序列,扩增产物用内切酶酶切后定向克隆到慢病毒载体PLenti-eGFP-NEO中,通过PCR、酶切及测序验证载体；将重组慢病毒载体和包装质粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE及pMD2G组成的四质粒系统,共转染293T细胞包装成慢病毒,收集含病毒颗粒的细胞上清液,浓缩和纯化后得到高效价的病毒液,转染293T细胞进行效价测定.结果 PCR扩增出约2241 bp的序列,构建的慢病毒载体测序结果与Genebank报道的目的基因序列一致；四质粒系统成功共转染入293T细胞中,在细胞中能够稳定表达,包装出了2.1×108TU/ml的病毒液.结论 成功构建了小鼠EZH2基因慢病毒载体,并得到2.1×108TU/ml高效价的病毒液.
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重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定基础.方法 设计引物扩增获得目的基因小鼠MIP-1α和B7-1基因的全长编码序列cDNA,将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体进行定向连接,其产物转化感受态细胞,对长出的阳性克隆进行PCR鉴定和直接测序序列分析.MIP-1α和B7-1目的基因质粒转染293T细胞,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,采用Western Blot法检测其蛋白表达,实时荧光定量PCR,检测慢病毒浓缩液的滴度.结果 成功构建了重组表达小鼠MIP-1α和B7-1基因的慢病毒载体,实时荧光定量PCR证实MIP-1α、B7-1基因重组慢病毒载体的滴度均达2.00E+8 TU/mL.结论 本研究成功构建并包装出高滴度的小鼠MIP-1α和B7-1基因重组慢病毒载体,为淋巴瘤基因治疗的实验研究奠定了基础.
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小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定.方法 应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定.将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定.以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量.结果 构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65× 108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达.结论 成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础.
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应用Gateway技术构建过表达β-catenin基因的慢病毒载体
目的 应用Gateway技术构建靶向过表达β-catenin基因的慢病毒载体,验证该载体的功能.方法 利用多位点Gateway克隆技术,通过BP重组反应,构建穿梭载体pDown-Ctnnb1；再通过LR重组反应,将pUp-EF1A、pDown-Ctnnb1、pTail-IRES/DsRed-Express2和母载体pLV.Des3d.P/puro 4个质粒构建成表达载体pLV.EX3d.P/puro-EF1A＞Ctnnb1 ＞IRES/DsRed-Express2;再转化到感受态细胞stbl3,经PCR筛选菌落阳性克隆测序鉴定.将成功构建的慢病毒表达载体转染293T细胞,用实时荧光定量PCR法验证重组载体对β-catenin基因mRNA水平的影响.结果 菌落PCR筛选和DNA测序鉴定显示入门克隆和表达载体插入片段序列正确,实时荧光定量PCR证实β-catenin基因mRNA水平显著上调(P＜0.01).结论 成功构建能显著上调β-catenin基因mRNA表达的慢病毒载体.
关键词： 多位点Gateway技术 β-catenin 过表达 慢病毒载体 293T细胞 -
耐辐射奇球菌pprM基因在真核细胞中的表达
目的 扩增耐辐射奇球菌辐射抗性基因pprM,构建pEGFP-C 1-pprM重组载体,转入293T细胞并表达PprM蛋白,为研究原核细胞辐射抗性基因pprM是否提高真核细胞的辐射抗性及其可能存在的作用机制奠定实验基础.方法 以无任何突变的pGEX-6p-1-pp rM重组质粒为模版,设计引物PCR扩增pprM基因,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收目的片段,EcoRI、BamHI双酶切回收的目的片段及质粒pEGFP-C1,将双酶切产物进行连接,连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于含卡那霉素(Kan)抗性的Luria-Bertani(LB)固体培养基上进行筛选,所筛选的阳性克隆进一步用菌落PCR,EcoR I、BamHI双酶切及测序鉴定.通过Lipofectamine2000转染试剂将pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,倒置荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达.裂解细胞抽提蛋白,Western blot进一步验证PprM蛋白的表达.结果 菌落PCR结果及双酶切结果显示,在400 bp左右处有一条明显的目的条带,测序结果显示碱基序列与原基因序列一致,载体构建成功.荧光拍照结果显示,pEGFP-C 1-pprM重组质粒成功转染293T细胞并表达绿色荧光融合蛋白;Western blot结果显示在40×103处有融合蛋白表达.结论 笔者成功将所构pEGFP-C 1-pprM重组质粒转入293T细胞,并表达相应蛋白,为后续实验研究原核基因pprM及其产物对真核细胞辐射抗性的影响奠定了良好的实验基础.
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人DC-SIGN基因表达质粒的构建及其表达
目的 构建含有人DC-SIGN基因的真核表达载体,并在293T细胞中表达目的 蛋白.方法 人血培养获得树突状细胞(DC),以DC的mRNA逆转录cDNA为模板,应用PCR体外扩增获得目的 DNA,用限制性内切酶Sal Ⅰ和BamH Ⅰ分别酶切VRC4409载体和PCR产物,通过连接、转化及克隆的筛选将目的 基因克隆入载体VRC4409,构建载体VRC4409-DC-SIGN,经PCR鉴定及测序分析证实,脂质体介导转染293T细胞,蛋白质印迹分析其表达DC-SIGN蛋白.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实VRC4409-DC-SIGN构建成功,DC-SIGN蛋白在293T细胞中成功表达.结论 成功构建质粒VRC4409-DC-SIGN并在293T细胞中表达目的 蛋白,为进一步研究DC-SIGN的生物学功能奠定了基础.
