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慢病毒介导的RNA干扰技术应用于抑制黑色素瘤细胞转移的特异性研究
目的 应用慢病毒介导的RNA干扰技术,对该技术能特异性的抑制黑色素瘤细胞转移进行研究.方法 以人巢蛋白(Human nestin)的信使RNA编码序列作为干扰靶点,把慢病毒基因PLL3.7作为质粒载体,人巢蛋白的“短发夹”RNA(shRNA)表达质粒和阴性对照shRNA表达质粒(不包含所有已知信使RNA),分别感染黑色素瘤细胞株UACC903细胞并流式分选获得高纯度的巢蛋白干扰或对照组细胞.用划痕法检测评估各组黑色素瘤细胞迁移能力.结果 巢蛋白下调的UACC903细胞侵袭能力和迁移能力均下降(P＜0.05).结论 慢病毒介导的RNA能有效地沉默巢蛋白基因的表达,从而能特异性的抑制黑色素瘤细胞迁移.
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外源基因转染细胞技术的研究进展
随着基因与蛋白功能研究的深入,目前已建立了许多细胞稳定转染的方法,将外源基因导入细胞内已作为一种专业技术在农业、医学和生物制药等领域展现出巨大的应用前景,在基因治疗层面上,为很多疾病的基础研究和临床治疗提供了有力的保障.细胞转染技术是将外源基因导入真核细胞的技术.根据转染载体的不同,转染类型可分为病毒载体和非病毒载体转染,病毒载体转染主要包括逆转录病毒、腺病毒相关病毒载体转染,非病毒载体转染常见的有脂质体转染、纳米材料为载体的转染等.
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慢病毒dUTPase结构与功能的研究进展
dUTPase是生物体遗传和基因复制的重要水解酶,它可以防止dUTP在DNA合成中的插入和错配,维持DNA复制的保真性和降低生物体发生突变的频率;同时还为DNA的合成提供必需的原料.对于慢性病毒来说,它还是构成病毒毒力及病毒高效复制的因素.因此,dUTPase可用于抗肿瘤细胞和抗病毒药物的筛选.本文对dUTPase的分布和进化关系、结构与功能的研究进展进行了概述.
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LMP-1基因慢病毒载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞的表达
目的:构建人LMP-1重组慢病毒载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,检测LMP-1基因在大鼠骨髓间充质干细胞的表达.方法:利用PCR法从cDNA文库中钓取LMP-1基因,将其与经Age Ⅰ酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU-EGFP相连接,转化感受态大肠杆菌,筛选出阳性克隆pGC-FU-LMP-1-EGFP,基因测序对其鉴定.经293T细胞包装后,收集富含病毒颗粒LV-LMP-1-EGFP的细胞上清,浓缩并标定滴度,RT-PCR检测并鉴定.以佳MOI值体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜观察转染是否成功,流式细胞仪检测转染效率,RT-PCR和Western blot检测转染细胞LMP-1基因的表达.结果:①基因测序及RT-PCR检测证实携带人LMP-1基因的慢病毒载体构建成功,包装后获得滴度为2× 108 TU/ml的LV-LMP-1-EGFP.②以MOI=100转染大鼠骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下可见大量绿色荧光蛋白表达,转染效率可达93.5％,经RT-PCR与Western blot检测,被转染细胞内有LMP-1基因表达.结论:成功构建携带人LMP-1基因的慢病毒载体,可高效转染大鼠骨髓间充质干细胞,被转染细胞可高效表达LMP-1基因.
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朊病毒研究进展
长期以来,对传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)病原因子的本质没有共识.曾提出种种假说,诸如肉孢子虫说、滤过性病毒说、慢病毒说和非寻常病毒说等.直至1982年,Prusiner等获得部分纯化的搔痒病(scrapie)病原因子提出朊病毒假说[1],才取得实质性进展.近十几年,朊病毒研究取得了突破性进展,逐渐得到认同.Prusiner也因这一领域的杰出贡献荣获1997年度诺贝尔医学奖.本文拟对这方面的进展作简要复习.
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马传染性贫血发病过程中细胞毒性T细胞的作用及其表位研究进展
马传染性贫血(Equine infectious anemia, EIA)是马属动物感染的一种主要经由虫媒传播的传染性疾病.该病的临床表征为反复发热、贫血、出血、水肿以及消瘦等,病理生理变化以血小板减少为主[1].EIA的致病原为马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus, EIAV),该病毒与人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV),猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus, SIV)等同属反转录病毒科,慢病毒属[2].EIA与HIV引起的人艾滋病和SIV引起的猴艾滋病在疾病特征上具有一定的相似性.然而,感染EIAV的多数马往往在经过一年左右的反复发热和与之相关联的病毒血症之后,终能够控制住病毒在体内的复制(而非清除),转归为无明显临床症状的EIAV隐性携带马[3],这与人在感染HIV 8～10年后几乎100%转归死亡是有明显差别的.也正是由于这一差别,研究马与EIAV之间相互作用的机理,可作为研究HIV等慢病毒致病机理和防治策略的良好动物模型.因此,人们对EIA发病及控制机理有了更多的关注和研究.其中,细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte, CTL)在病毒感染控制过程中起主要作用这一观点,随着相关研究的逐步深入,越来越得到人们的认同.
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共表达丙性肝炎病毒结构蛋白及分泌型荧光素酶Gluc的慢病毒制备与鉴定
旨在制备共表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)结构蛋白及分泌型荧光素酶Gluc慢病毒VSVpp-HCV.通过构建共表达HCV结构蛋白及分泌型荧光素酶Gluc的慢病毒表达载体pCSGluc2aCE1E2,与包膜质粒pVSVG,包装质粒pHR'CMV△8.2共转染HEK 293T的方式获取慢病毒,将慢病毒感染细胞后,对细胞上清中Gluc荧光素酶活性、细胞中HCV特异蛋白的表达等进行表达鉴定.结果表明:浓缩后获得的慢病毒浓度为1×108TU/mL,电镜负染观察到直径约为100nm带包膜的浓缩慢病毒颗粒;慢病毒VSVpp-HCV感染细胞后,细胞内HCV特异蛋白及上清中Gluc荧光素酶的表达呈平行关系.因此通过检测Gluc荧光素酶的表达水平可反映HCV结构蛋白表达水平,这为建立基于慢病毒感染的带有报告基因的HCV转基因小鼠模型提供了基础.
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Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立
人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少.本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型.将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体.运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF.遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达.感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响.限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确.病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高.在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白.这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达.Dox的佳工作浓度为400ng/mL,佳诱导时间为12h至24h之间.这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础.
关键词： 慢病毒诱导表达 Tet-On3G pUL23 人巨细胞病毒(HCMV) 慢病毒 -
RNAi介导的pirin低表达降低了K562细胞的红系分化能力
目的 研究pirin低表达对人红白血病细胞系K562红系分化和细胞活力的影响.方法 通过短发卡RNA(shRNA)干扰技术,构建pirin低表达细胞稳定株,用Western blot方法对干扰效果进行检测,并用联苯胺染色和MTT法分别检测下扰pirin后对K562细胞的红系分化和增殖的影响.结果 转染了pirin-shRNA的细胞其pirin的表达量明显低于对照组(随机干扰组),pirin低表达与对照组相比对细胞增殖无影响,但在诱导剂诱导分化过程中,血红蛋白的合成出现了显著性的降低(P＜0.05).结论 Pirin低表达不影响K562细胞的增殖能力,但能降低其红系分化能力.
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OPN siRNA慢病毒载体的构建及其对大肠癌细胞增殖的抑制作用
目的 构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌SW480细胞增殖的调节作用.方法 设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒.应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激SW480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对SW480细胞增殖的调节作用.结果 成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒.该重组慢病毒可使SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对SW480细胞增殖有明显的抑制作用(P＜0.05).结论 成功构建的LV-siRNA-OPN慢病毒可以有效抑制SW480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制SW480细胞的增殖.
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NSBP1基因干扰RNA慢病毒载体的构建及效应检测
目的 构建和鉴定NSBP1基因RNA干扰慢病毒表达载体.方法 针对NSBP1 mRNA设计了3条siRNA,并构建pGCSIL-GFP-NSBP1慢病毒质粒,测序鉴定.用pGCSIL-GFP-NSBP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度.将慢病毒转染前列腺癌DU145细胞,Western-blot检测NSBP1表达,MTT法检测细胞生长活性,用转染细胞种植裸鼠成瘤,观察抑瘤效果.结果 PCR和测序证实,成功构建LV-shNSBP1的慢病毒载体,病毒滴度达2×10~8TU/mL.转染细胞中NSBP1蛋白表达显著降低,且MTT检测细胞生长活性明显减慢,转染细胞在裸鼠体内成瘤率没有影响,但对肿瘤的生长有明显抑制作用.结论 人NSBP1基因RNA干扰慢病毒载体构建成功,且NSBP1对前列腺癌激素非依赖DU145细胞的生长具有重要作用.
关键词： RNA干扰 核小体结合蛋白 慢病毒 Western blot MTT -
MicroRNA-29b重组慢病毒表达载体的构建及其抑制胃癌细胞系的迁移和增殖
目的 构建has-miR-29b重组慢病毒的表达载体,并观察其对胃癌细胞系迁移和增殖能力的影响.方法 将PCR扩增的miR-29b前体序列和pMIR载体经双酶切后连接产生pMIR-miR-29b慢病毒表达载体.pMIR-miR-29b、Packaging Plasmid(s)和pVSV-G质粒共转染包装细胞系293TN,包装产生慢病毒.使用收获的慢病毒颗粒感染胃癌细胞系HGC-27,72 h后利用real-time PCR检测miR-29b在HGC-27内的表达水平,Western blot检测其靶基因MCL-1的表达.划痕实验和细胞增殖实验分别观察在HGC-27细胞中过表达miR-29b后细胞迁移能力及增殖能力的变化.结果 成功构建了miR-29b重组慢病毒的表达载体,感染胃癌细胞HGC-27后,能够成功过表达miR-29b.在HGC-27细胞中过表达miR-29b,其靶基因MCL-1的表达明显被抑制,并且Lenti-29b组与对照组Untreat组和Lenti-vector组相比,Lenti-29b组的迁移能力显著降低(P<0.01);Lenti-29b组与Lenti-vector组相比,Lenti-29b组在48、72及96 h 3个时间点的增殖能力均显著下降(P<0.01).结论 成功获得过表达miR-29b的重组慢病毒颗粒,miR-29b能够抑制其靶基因MCL-1的表达,并对HGC-27细胞的迁移和增殖有明显的抑制作用.
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靶向TPX2基因shRNA慢病毒载体的构建及鉴定
目的 构建靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体,获得稳定感染的人宫颈癌HeLa细胞株,为宫颈癌细胞TPX2基因的相关研究奠定基础.方法 以TPX2基因为靶点,设计并合成四组对应于目标shRNA的双链DNA发卡结构,分别与慢病毒载体Pglv2-U6-Puro连接经转化感受态细胞,阳性克隆经测序、病毒包装、滴度测定、感染细胞、嘌呤霉素筛选得到TPX2基因沉默稳转细胞株.实时荧光定量PCR和Western blot检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果.流式细胞计量术检测其对细胞周期分布及凋亡的影响.结果 测序结果证实5种慢病毒载体均包装成功,采用0.4 μg/mL嘌呤霉素成功筛选出TPX2沉默细胞株.HeLa细胞感染4种载有TPX2-shRNA的重组慢病毒后,均发挥了沉默效应,尤以TPX2-shRNA-1沉默效果佳,TPX2 mRNA相对表达量为0.21±0.07,低于对照组的1.08±0.07(P＜0.01);TPX2蛋白质相对表达量为0.19±0.28,低于对照组的0.64±0.03(P＜0.01);G2及S期细胞高于对照组(P＜0.05);细胞凋亡率明显多于对照组(P＜0.05).结论 获得了一种有效TPX2基因的干扰序列,成功构建了TPX2shRNA慢病毒干扰载体,并筛选出TPX2基因沉默的HeLa细胞株,为进一步研究TPX2基因在宫颈癌中的作用奠定了基础.
关键词： 宫颈癌 TPX2-shRNA 慢病毒 -
ATF4重组慢病毒抑制C2C12细胞增殖并促凋亡
目的 构建人活性转录因子4(ATF4)慢病毒,探讨C2C12细胞成骨分化过程中ATF4基因慢病毒修饰对其增殖和凋亡的影响.方法 构建ATF4重组慢病毒载体质粒,然后与2个包装质粒共转入293T细胞中包装成ATF4慢病毒(LV-ATF4);用病毒感染C2C12细胞,并用流式细胞仪(FCM)检测BMP2诱导C2C12细胞分化时对其增殖凋亡的影响,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达,电子显微镜观察凋亡细胞的形态学结构变化.结果 成功构建和包装了ATF4重组慢病毒.FCM检测结果表明,BMP2+ LV-ATF4处理组S期细胞(14.89％)低于BMP2+ LV-GFP组(30.64％) (P ＜0.05);BMP2+ LV-ATF4处理组细胞凋亡率(31.06％)高于BMP2+ LV-GFP组(11.39％)(P＜0.05);凋亡相关蛋白的表达与FCM结果一致.结论 在BMP2诱导C2C12细胞成骨分化时,LV-ATT4慢病毒可促进C2C12细胞的凋亡,抑制其增殖.
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SFRP5基因沉默促进人类胰腺癌细胞系PANC-1增殖与迁移
目的 探讨慢病毒介导短发夹RNA( shRNA)沉默SFRP5基因对人类胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响.方法 构建靶向SFRP5基因特异性shRNA慢病毒载体并转染人胰腺癌PANC-1细胞系,以空白质粒转染阴性对照组,未处理细胞做为空白对照组.用 real-time PCR及Western blot检测转染前后SFRP5 RNA以及蛋白的表达;CCK-8实验检测细胞体外增殖能力;使用Transwell小室实验分析细胞侵袭能力;细胞划痕实验分析细胞迁移能力.结果 成功建立稳定转染shRNA-SFRP5胰腺癌PANC-1细胞株.SFRP5病毒转染组与阴性对照组及空白对照组相比细胞的增殖能力明显增加(P<0.01);SFRP5病毒转染组的细胞侵袭、迁移能力明显高于阴性对照组及空白对照组(P<0.01).结论 SFRP5慢病毒干扰载体能有效抑制SFRP5基因在人胰腺癌PANC-1细胞中的表达,进而促进细胞的增殖、侵袭和迁移.
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敲减水通道蛋白1对小鼠雪旺细胞形态及水转运的影响
目的 探讨水通道蛋白1(AQP1)基因表达和雪旺细胞肿胀之间的关系.方法 细胞免疫荧光双标法验证小鼠面神经来源的原代雪旺细胞AQP1表达;应用慢病毒RNA干扰技术下调雪旺细胞AQP1表达;AQP1-shRNA感染雪旺细胞后,与CTRL组(scr-shRNA)比较,每天在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,连续6d;细胞容积测定量化AQP1-shRNA细胞与CTRL (scr-shRNA)细胞水含量变化;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测AQP1-shRNA对雪旺细胞凋亡的影响.结果 小鼠面神经来源的原代雪旺细胞表达AQP1;构建的小鼠AQP1-shRNA慢病毒载体感染雪旺细胞后,能在mRNA和蛋白水平明显抑制AQP1表达(P＜0.05);AQP1-shRNA能使雪旺细胞形态皱缩,细胞水含量明显降低(P＜0.01);AQP1-shRNA细胞较CTRL组细胞增殖活力低(P＜0.05),但不会引起雪旺细胞明显的凋亡.结论 AQP1是控制雪旺细胞快速水转运的主要因素,抑制AQP1表达可能提供一种临床治疗面神经水肿的新方法.
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慢病毒介导的SEMA3G过表达对人胰腺癌细胞系PANC-1的作用
目的 通过体外实验探讨过表达SEMA3G对人胰腺癌细胞PANC-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响.方法 将携带SEMA3G的慢病毒载体转染人胰腺癌PANC-1细胞系,利用real-time PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白质水平.CCK-8法检测细胞增殖,transwell实验检测细胞侵袭和细胞划痕试验检测细胞的迁移.结果 成功建立稳定转染SEMA3G胰腺癌PANC-1细胞系.SEMA3G病毒感染组与空白对照组和阴性对照组相比细胞的增殖能力显著降低(P＜0.05),SEMA3G病毒感染组的细胞侵袭和迁移能力明显低于两组对照组(P＜0.05).结论 SEMA3G慢病毒载体能有效过表达人胰腺癌PANC-1细胞中内源性SEMA3G蛋白,进而抑制细胞增殖、侵袭和迁移.
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慢病毒介导GDNF基因对食蟹猴骨髓间充质干细胞生物学特性的影响
目的 探讨慢病毒介导胶质源性神经营养因子(GDNF)对食蟹猴骨髓间充质干细胞(cMSCs)生物学特性的影响.方法 无菌条件下取食蟹猴骨髓,梯度密度离心法分离培养cMSCs,以含有GDNF基因的慢病毒感染cMSCs.利用ELISA、Real-time PCR、流式细胞术(FCM)、BrdU掺入法等实验方法,观察慢病毒感染后GDNF基因的表达,以及慢病毒感染前后的cMSCs的表面抗原表达、体外增殖和分化能力.结果 感染慢病毒后,体外培养的cMSCs高表达GDNF.慢病毒感染后cMSCs的细胞形态无明显改变,细胞表面标志CD34、CD90和Stro-1阳性细胞比例增高.BrdU掺入结果显示,与对照组(0.61±0.11)比较,GDNF慢病毒感染组(0.50±0.13)明显降低(P＜0.05).但GDNF慢病毒感染并没有影响cMSCs体外脂肪诱导分化能力.结论 慢病毒感染影响cMSCs的表面抗原表达和体外增殖能力,但对cMSCs体外脂肪分化能力无影响.
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MicroRNA-26a的表达对急性髓系白血病细胞增殖的影响
目的 观察构建has-miR-26a重组慢病毒的表达载体对急性髓系白血病细胞增殖能力的影响.方法 构建人MicroRNA-26a慢病毒表达载体(LV-miR-26a-GFP)并感染人急性髓系白血病细胞系NB4；分为未感染组、感染组(感染LV-miR-26a-GFP)以及阴性对照组(感染LV-GFP)；用real-time RT-PCR检测miR-26a在NB4细胞内的表达水平,Western blot检测PTEN的表达；用CCK-8法绘制细胞的生长曲线和软琼脂克隆形成实验检测细胞的增殖.结果 成功构建miR-26a重组慢病毒的表达载体,感染白血病细胞NB4后,能够成功过表达miR-26a.生长曲线的结果显示与感染LV-GFP阴性对照组和未感染组相比,LV-miR-26a-GFP感染组细胞的增殖速度显著增加(P＜0.01),软琼脂克隆形成实验证实了感染LV-miR-26a-GFP的NB4细胞的克隆形成能力(GFP+克隆数为75+10)与阴性对照组(感染LV-GFP)相比(GFP+克隆数为26 +5)显著增强(P＜0.05).在NB4细胞中过表达miR-26a后,其靶基因PTEN的表达明显被抑制.结论 MicroRNA-26a的表达可增强急性髓系白血病细胞的增殖能力,促进白血病细胞的增殖.
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生长因子受体结合蛋白-2抑制肠癌细胞HT29增殖
目的 研究Grb2 shRNA转染对肠癌细胞HT29增殖相关信号通路的影响,探讨以Grb2为肠癌治疗靶点的可行性.方法 应用shRNA慢病毒质粒系统,将Grb2 shRNA转染至293T细胞,获得5株不同序列Grb2 shRNA慢病毒颗粒,并感染肠癌HT29细胞,分别获得的5株感染Grb2 shRNA慢病毒颗粒的肠癌HT29细胞系为实验组(即感染Grb2 shRNA的细胞HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-70、HT29/shGrb2-71、HT29/shGrb2-72、HT29/shGrb2-73),以eGFP shRNA慢病毒感染肠癌HT29细胞为阴性对照组.MTT法检测细胞增殖情况,RT-PCR检测Grb2 mRNA表达,Western blot检测Grb2、P42/44 ERK、磷酸化P42/44 ERK、Akt、磷酸化Akt(P-Akt)和STAT5等信号通路分子表达的改变.结果 感染shGrb2病毒72 h,HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73两株细胞在mRNA和蛋白水平均出现抑制现象.HT29/shGrb2-69、HT29/shGrb2-73细胞在感染后24h A值分别为0.176±0.045,0.186±0.013,感染48 h后为0.347±0.048、0.382±0.041均显著高于空白对照、阴性对照(P ＜0.001),72 h为0.934±0.038、0.983±0.205高于空白对照、阴性对照(P＜0.01);感染后72 h,phospho-P42/44 ERK、Akt、phospho-Akt明显下降,而ERK、STAT5表达不受影响.结论 在HT29细胞,Grb2 mRNA和蛋白水平上明显抑制,可诱导HT29细胞增殖和相关信号传导通路分子表达下调.
