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miRNA－29c在大鼠脑缺血再灌注神经损伤中的保护作用与机制
目的：探讨miRNA－29c在大鼠脑缺血再灌注神经损伤中的保护作用与机制研究。方法48只雄性SD大鼠随机分为假手术组，模型组，miR－29c NC组，miR－29c inhibitor组，除假手术组外，其余三组均采用拴线法建立大鼠大脑中动脉局灶缺血再灌注损伤模型，并于术后24 h评价大鼠神经行为变化，检测大鼠脑梗死体积，缺血侧脑组织细胞凋亡情况，脑组织中miR－29c表达量，超氧化物岐化酶（ SOD）活性，丙二醛（ MDA）含量，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase 3），Caspase 8及Caspase 9活性，及Bcl－2，Bax，Bak1，cleaved caspase 3，cleaved caspase 8与cleaved caspase 9蛋白表达。结果与假手术组比较，模型组，miR－29c NC组中miR－29c表达量显著提高，大鼠神经行为评分提高，脑梗死体积增加，细胞凋亡率提高，SOD活性降低，MDA含量，Caspase 3，Caspase 8及Caspase 9活性上升，Bcl－2表达量下调，Bax，Bak1，cleaved caspase 3，cleaved caspase 8及cleaved caspase 9表达量上调，差异均具有统计学意义（P＜0．01）。与模型组及miR－29c NC组比较，miR－29c inhibitor组miR－29c表达量显著降低，大鼠神经行为评分降低，脑梗死体积百分比减少，细胞凋亡率降低，SOD 活性上升，MDA含量，Caspase 3， Caspase 8及Caspase 9活性降低，Bcl－2表达量上调，Bax，Bak1，cleaved caspase 3，cleaved caspase 8及cleaved caspase 9表达量下调，差异均具有统计学意义（P＜0．01）。结论 miR－29c对大鼠脑缺血再灌注神经损伤具有保护作用，与提高抗氧化能力及调控细胞凋亡相关蛋白表达有关。
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小鼠miR-29c过表达慢病毒载体的构建与鉴定
目的 构建小鼠miR-29c过表达重组慢病毒载体,并对表达产物进行鉴定.方法 应用PCR法从小鼠MLE-12细胞中提取pre-miR-29c基因,测序后将其克隆到pLenti-CMV-EGFP慢病毒载体,通过PCR筛选及测序对阳性克隆进行鉴定.将miR-29c过表达慢病毒载体转染至293T细胞,进行慢病毒的包装和滴度测定.以RT-PCR检测慢病毒转染MLE-12细胞中miR-29c的表达量.结果 构建miR-29c慢病毒表达载体Lv-miR-29c经PCR和测序鉴定正确,并获得滴度为5.65× 108 IU/ml的病毒浓缩液,转染MLE-12细胞后miR-29c基因成功过表达.结论 成功构建miR-29c过表达慢病毒载体,为进一步研究miR-29c的功能奠定实验基础.
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miR-29c在卡波西肉瘤SLK细胞增殖和侵袭过程中的作用研究
目的 探讨miR-29c在卡西波内瘤(KS)细胞中的表达情况以及miR-29c在KS细胞侵袭和迁移过程中的作用及其机制.方法 qPCR检测KS细胞中miR-29c的表达情况;使用miR-29c-mimic过表达miR-29c,qPCR检测miR-29c-mimic过表达效果;Transwell侵袭实验检测miR-29c的过表达对KS细胞侵袭能力的影响;划痕实验检测miR-29c的过表达对KS细胞迁移能力的影响;CM-H2DCFDA荧光染色细胞检测KS细胞内活性氧水平.结果 miR-29c在KS SLK细胞中表达水平较低,miR-29c-mimic可以有效增加miR-29c的表达:过表达miR-29c抑制KS SLK细胞的侵袭迁移能力;过表达miR-29c后可以降低KS SLK细胞内活性氧水平.结论 miR-29c在KS细胞中表达下调,同时过表达miR-29c可以抑制KS细胞侵袭和迁移能力.
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125碘粒子植入联合肿瘤切除术治疗脑胶质瘤患者疗效及对血清miR-128、miR-29c表达的影响
目的 探究125碘粒子植入联合肿瘤切除术治疗脑胶质瘤的临床效果及对患者血清miR-128、miR-29c表达的影响.方法 选取2015年3月—2018年3月于郴州市第一人民医院神经外科接受治疗的脑胶质瘤患者80例,按照随机数字表法分为对照组和观察组,每组各40例.对照组患者给予开颅肿瘤切除术,观察组患者在对照组的基础上给予125碘粒子植入治疗.荧光定量PCR法检测血清中miR-128和miR-29c表达水平,选用KPS功能状态评分对患者的功能状态进行衡量,比较2组患者的不良反应发生情况.结果 观察组患者治疗总有效率为95.00％,显著高于对照组的80.00％,差异具有统计学意义(χ2=4.114,P=0.043).肿瘤分化程度Ⅰ～Ⅱ级患者血清miR-128表达高于Ⅲ～Ⅳ级患者(χ2=3.643,P=0.000),miR-29c表达水平低于Ⅲ～Ⅳ级患者(χ2=3.934,P=0.000).治疗后,2组患者血清中miR-128水平均降低,miR-29c水平均升高,且观察组的变化明显优于对照组,差异有统计学意义(t/P=3.468/0.001,t/P=5.926/0.000).治疗后2组患者KPS评分均明显提高,且观察组患者的KPS评分显著高于对照组,差异具有统计学意义(t=8.519,P=0.000).观察组患者的不良反应发生率为5.00％,显著低于对照组的20.00％,差异有统计学意义(χ2=4.114,P=0.043).结论 采用125碘粒子植入联合肿瘤切除术治疗脑胶质瘤的效果明显优于单独采用肿瘤切除术,不仅可以改善患者血清中miR-128、miR-29c的表达水平,且不良反应发生率较低.
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miR-29c真核表达载体构建及鉴定
目的 构建pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c真核表达载体,为进一步研究miR-29c的功能和靶基因鉴定奠定基础.方法 根据miR-29c成熟体序列设计合成1对miRNA寡聚单链DNA,经退火后克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR中,瞬时转染肺腺癌A549细胞后,经实时荧光定量PCR检测pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c在肺癌细胞中表达miR-29c.结果 A549转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c 24 h后,miR-29c表达量上升,明显高于阴性对照,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 成功构建真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-29c,并能有效表达miR-29c.
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miR-92a和miR-29c对直肠癌细胞增殖和侵袭的影响
目的 探讨miR-92a与miR-29c在直肠癌细胞中的表达对直肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 应用miR-92a inhibitor,miR-29c mimic在体外转染直肠癌细胞系HT-29,分别构建miR-92a的干扰表达和miR-29c的过表达,设置转染无义序列组作为对照组.采用反转录合成cDNA和荧光定量PCR,以U6表达作为内对照,检测细胞中miR-92a,miR-29c的表达;采用CCK-8法,通过检测转染直肠癌细胞后不同时期细胞增殖能力;采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力,分析miR-92a,miR-29c的相对表达量与直肠癌细胞增殖和侵袭的关系.结果 与对照组相比,转染miR-92 inhibitor后,直肠癌细胞系HT-29的miR-92a表达水平均明显降低,增殖能力和侵袭能力均受到明显抑制;而转染miR-29c mimic后,直肠癌细胞系HT-29中miR-29c表达水平均明显提高,但HT-29细胞系的增殖能力和侵袭能力却均受到明显抑制.结论 miR-92a促进癌细胞增殖和侵袭,miR-29c抑制直肠癌细胞的增殖和侵袭.
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低氧诱导因子短期活化后诱导 miR-29c表达上调可延缓5／6肾切除大鼠的肾病进展
目的：探讨适度活化低氧诱导因子（hypoxia‐inducible factor ，HIF）对延缓残肾慢性肾脏病进展的作用及可能机制。方法：雄性SD大鼠采用二步法5／6肾大部切除术建立残肾模型，随机分为L‐mimosine （L‐Mim）治疗组（术后5～12周短期给予脯氨酸羟化酶抑制剂，隔日50 mg／kg腹腔给药）和未治疗残肾组，同时设立假手术对照组。术后12周末处死大鼠留取标本。结果：L‐Mim治疗组大鼠血肌酐水平[（82．4±6．3）比（130．1±24．1）μmol／L ， P＜0．05]、24 h尿蛋白水平[（0．7±0．1）比（1．7±0．5） g／d ，P＜0．05]以及残肾病理改变较未治疗残肾组大鼠有显著改善。miRNA芯片分析结果提示：L‐Mim治疗组肾皮质miR‐29c丰度高于未治疗残肾组，伴 HIF‐1α和 HIF‐2α表达增强。经荧光素酶报告检测系统和体外突变实验明确原肌球蛋白1（TPM1）为miR‐29c靶基因之一。HK2细胞转染pre‐miR‐29c寡核苷酸后可以抑制 TGF‐β1（3 ng／mL ，24 h）诱导的原肌球蛋白水平上调（P＜0．05或0．01）。结论：大鼠残肾肾间质纤维化病变明显并伴miR‐29c水平下调，适度活化 HIF水平可通过上调miR‐29c表达延缓残肾功能恶化。
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结肠癌细胞增殖和侵袭过程中miR-92a和miR-29c的表达及其意义
目的 探讨miR-92a和miR-29c表达水平对结肠癌细胞增殖和侵袭能力的影响.方法 应用 miR-92a inhibitor、miR-29c mimic 在体外转染结肠癌细胞系SW480,分别构建miR-92a的干扰表达和miR-29c的过表达,设置转染无义序列组作为对照组.(1)采用反转录合成cDNA和荧光定量PCR,以U6表达作为内对照,检测细胞中miR-92a和miR-29c的表达水平;(2)采用CCK-8法,通过检测转染结肠癌细胞后不同时期的450 nm处吸光度值,测定细胞增殖能力;(3)采用Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力,分析miR-92a和miR-29c的相对表达量与结肠癌细胞增殖和侵袭的关系.结果 (1)与对照组相比,转染miR-92a inhibitor后,结肠癌细胞系SW480的miR-92a表达水平明显降低(P<0.01),增殖能力和侵袭能力均受到明显抑制(P<0.01);(2)转染miR-29c mimic后,结肠癌细胞系SW480中miR-29c表达水平明显升高(P<0.01),但SW480细胞系的增殖能力和侵袭能力均受到明显抑制(P<0.01).结论 miR-92a在结肠癌细胞中过表达能提高肿瘤细胞的增殖能力和侵袭能力,miR-29c则发挥着相反的作用.
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miR-29c通过TNRC18调控胃癌组织和细胞阿帕替尼耐药的机制
目的:探讨miR-29c调控TNRC18胃癌组织和细胞阿帕替尼耐药性的机制.方法:收集2015年2月至2017年10月武汉市中心医院具有完整资料的39例胃癌和癌旁组织标本(其中21例为阿帕替尼耐药患者、18例为不耐药患者),采用qRT-PCR检测miR-29c在胃癌组织和细胞系中的表达水平.采用CCK-8、Transwell和AnnexinV-FITC/PI双染流式术检测miR-29c过表达/敲降对MGC-803/AP耐药细胞增殖、侵袭和凋亡影响,Western blotting检测miR-29c调控TNRC18表达,双荧光素酶报告基因验证miR-29c与TNRC18的靶向作用关系.结果:miR-29c在3种胃癌细胞系和阿帕替尼耐药癌患者组织中均低表达.双荧光素酶报告基因证实miR-29c靶向作用TNRC18并下调其表达水平.miR-29c通过靶向下调TNRC18抑制阿帕替药耐药的MGC-803/AP细胞的增殖、侵袭并促进细胞凋亡(均P＜0.05或P＜0.01),进而降低胃癌细胞MGC-803/AP对阿帕替尼的耐药性.体内实验同样证实,miR-29c通过靶向抑制TNRC18降低胃癌对阿帕替尼的耐药性.结论:miR-29c/TNRC18分子轴在胃癌组织和细胞MGC-803/AP对阿帕替尼耐药中发挥着一定作用,过表达miR-29c可逆转MGC-803/AP细胞对阿帕替尼耐药.
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miRNA-29c抑制前列腺癌细胞系LNCaP的增殖和侵袭
目的 观察miRNA-29c(miR-29c)对前列腺癌细胞系LNCaP增殖和侵袭能力的影响,探讨其潜在的应用价值.方法 采用qRT-PCR观察雄激素依赖性(LNCaP)与雄激素非依赖性(LNCaP-AI)前列腺癌细胞中miR-29c的表达差异;采用miR-29c抑制物(anti-miR-29c)下调LNCaP细胞中miR-29c的表达量,绘制LNCaP细胞生长曲线,利用流式细胞仪测定细胞周期;Transwell侵袭实验分析miR-29c抑制前后LNCaP细胞的体外侵袭能力.结果 qRT-PCR显示LNCaP-AI细胞中miR-29c水平明显低于LNCaP细胞(P<0.05);下调LNCaP细胞中miR-29c的表达量,可明显促进LNCaP细胞体外增殖及侵袭能力(P<0.05).结论 miR-29c的正常表达有利于抑制LNCaP细胞的体外增殖和侵袭,有望成为前列腺癌生物治疗的潜在靶点.
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miR-29c过表达载体的构建及其对95D肺癌细胞增殖的影响
目的 构建miR-29c真核表达载体并转染95D肺癌细胞,观察miR-29c过表达对95D细胞增殖能力的影响.方法 克隆miR-29c片段插入质粒pcDNA3.1,构建miR-29c表达质粒pcDNA3.1-miR-29c;通过脂质体瞬时转染人肺癌细胞株95D,荧光PCR检测细胞miR-29c表达水平,MTT法检测过表达miR-29c对细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒pcDNA3.1-miR-29c经酶切及测序证明构建成功,荧光PCR证实转染后95D细胞miR-29c表达水平显著升高,是对照组的36倍.MTT检测结果表明,过表达miR-29c的95D细胞增殖受到显著抑制,至72 h抑制率高,达38.63％.结论 成功构建miR-29c真核表达质粒pcDNA3.1-miR-29c,初步观察显示过表达miR-29c显著抑制95D肺癌细胞增殖效应.为进一步深入研究miR-29c对肺癌的作用打下良好基础.
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miR-21、miR-29c和miR-182鉴别诊断良恶性胸腔积液
目的:评价miR-21、miR-29c和miR-182在良恶性胸腔积液鉴别诊断中的应用价值.方法:应用荧光定量PCR检测65例恶性胸腔积液患者及61例良性胸腔积液患者胸腔积液标本中miR-21、miR-29c和miR-182的表达水平,并比较三者在良、恶性胸腔积液中的表达差异.构建ROC曲线,获取曲线下面积(AUC),确定诊断恶性胸腔积液的临界值,计算敏感度、特异度等指标,并与癌胚抗原进行比较.结果:恶性胸腔积液中miR-21和miR-182的表达水平均明显高于良性胸腔积液(P＜0.05),而miR-29c的表达水平则显著低于良性胸腔积液(P＜0.05).ROC曲线显示miR-21、miR-29c和miR-182的AUC值分别为0.873 (95％ CI:0.808 ～0.939)、0.856(95％ CI:0.790～0.920)和0.841 (95％ CI:0.772 ～0.911),高于癌胚抗原(0.822,95％ CI:0.703 ～0.873).miR-21、miR-29c和miR-182诊断恶性胸腔积液的敏感度分别为83.1％、78.5％、83.1％,特异度分别为85.2％、81.5％、73.4％,亦高于癌胚抗原诊断恶性胸腔积液的敏感度及特异度(75.4％和71.2％).联合检测胸腔积液中miR-21、miR-29c、miR-182和癌胚抗原可提高诊断的敏感度(93.8％)和特异度(90.2％).结论:miR-21、miR-29c和miR-182有可能成为临床鉴别诊断良恶性胸腔积液的标志物.
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miR-29c过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响
目的:探讨microRNA-29c(miR-29c)过表达对P19细胞增殖、凋亡和分化的影响及机制.方法:体外传代培养P19细胞,利用细胞转染技术构建miR-29c过表达细胞(mimic组).CCK-8试剂盒检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞周期;Hoechst染色结合流式细胞技术检测细胞凋亡情况,定量PCR和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测凋亡相关因子Bax/Bcl-2表达情况;二甲亚砜(DMSO)诱导P19细胞分化,定量PCR检测心肌特异性标志基因肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain, αMHC),转录因子GATA4和心肌增强因子2c(myocyte enhancer factor 2c,Mef2c)表达情况,明确miR-29c过表达对P19细胞分化的影响;生物信息学分析结合荧光素酶报告实验和Western blot明确miR-29c的靶基因.结果:与对照组相比,miR-29c过表达组细胞增殖速率较慢,细胞周期S期比例降低;miR-29c过表达组细胞凋亡率增高,Bax表达水平增高,而Bcl-2表达无明显差异;P19细胞分化第6天和第8天miR-29c过表达组αMHC、GATA4和Mef2c的表达水平显著高于对照组;Akt3被证实为miR-29c的靶基因.结论:miR-29c过表达可能是通过调控Akt3来抑制P19细胞增殖、促进P19细胞的凋亡和分化.
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MicroRNA-29c在单侧输尿管梗阻大鼠中的表达及意义
目的:观察microRNA-29c(miR-29c)在大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型肾组织中的表达变化,探讨其是否参与肾间质纤维化及其可能机制.方法:高通量测序技术和实时荧光定量PCR检测miR-29c在UUO大鼠术后1d和3d肾脏组织中的表达情况.使用生物信息学预测miR-29c靶mRNA,对其靶mRNA进行Gene Ontology和pathway分析.结果:UUO大鼠术后1 d和术后3d手术侧肾组织miR-29c表达下调,Co1 I mRNA和FN mRNA的表达升高.预测靶mRNA经分析后获得miR-29c有统计学意义的10个靶mRNA,其中6个编码细胞外基质蛋白.结论:miR-29c在大鼠UUO模型早期的肾组织中表达下调,可能通过促进细胞外基质堆积参与肾间质纤维化的发生发展.
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MiR-29 c模拟物对骨肉瘤细胞侵袭和迁移能力的影响
目的：观察miR-29c在具有不同转移能力的F4和F5M2细胞系中的表达差异；研究miR-29c模拟物对骨肉瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。方法：利用qRT-PCR技术检测F4与F5M2间miR-29c的表达差异；将骨肉瘤细胞F5M2分为3组，运用细胞转染技术分别对两组转染miR-29c模拟物、模拟物阴性对照，第3组不作处理，随后用qRT-PCR技术检测3组间miR-29c的表达差异。Transwell法检测3组不同处理的F5M2细胞的侵袭和迁移能力是否存在差异。结果：MiR-29c在F4和F5M2细胞系中表达差异显著，miR-29c在高转移性的F5M2细胞中表达水平显著下降。与阴性对照组和空白组相比，转染miR-29c模拟物的F5M2细胞侵袭和迁移能力均明显减弱，且差异具有统计学意义（ p<0.05）。结论：MiR-29c在高转移性骨肉瘤细胞中低表达，且miR-29c模拟物具有抑制骨肉瘤细胞侵袭和转移的作用。MiR-29c有可能作为骨肉瘤转移基因治疗的一个新靶点。
