首页 > 文献资料
-
内耳毛细胞再生的前体细胞及其发育调调控基因
自从在鸟类等非哺乳脊椎动物中发现毛细胞再生现象至今已有20年,人们对毛细胞再生的研究也取得了丰硕的成果,而且有可能从试验性研究向临床应用性研究发展.目前对内耳毛细胞再生方面的研究,尤其是再生毛细胞的前体细胞和再生机制的探讨日益增多.本文将对毛细胞再生的前体细胞进行简单介绍,并对参与内耳毛细胞形成的相关蛋白,Notch信号途径及Math1基因进行综述,以进一步了解毛细胞产生的机制.
-
三种方法转染Math1基因效率和细胞毒性研究
目的 比较腺病毒、脂质体、纳米材料三种不同类型的载体体外携带目的 基因Math1对HEK293T细胞的转染效率及细胞毒性的大小,以期筛选理想的基因转染载体材料.方法 选用重组腺病毒、LipofectamineTM 2000、Superfect纳米材料作为转染载体,携带含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)报告基因的Math1-EGFP基因及真核表达质粒pRK5-Math1-EGFP,并且根据不同转染载体说明步骤优化体外转染条件,分别转染293T细胞.在一定的时间内利用荧光显微镜观察细胞转染结果并计数阳性细胞,采用MTT(噻唑蓝)法检测三种不同载体体外细胞毒性,应用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)技术检测转染阳性细胞中目的 基因Math1的mRNA表达情况.结果 在优化的体外转染条件下,重组腺病毒载体介导的细胞转染率达到了94％以上,脂质体和商品化Supeffect纳米材料转染的细胞中,荧光蛋白表达率分别为73％和80％以上,同时,商品化Superfect纳米材料在达到80％转染率的条件下,细胞存活率为90％.应用RT-PCR方法 证实,三种载体转染细胞均有Math1基因的mRNA的表达.结论 商品化Supeffect纳米材料作为一种新型的、安全有效的纳米转染材料,能够成功携带耳聋治疗关键基因Math1转染293T细胞,以期在内耳基因治疗的研究当中得到有效的应用.
-
bFGF-Math1基因诱导UEC-4细胞产生毛细胞的实验研究
目的进一步探讨bFGF-Math1基因在前庭上皮细胞系(UEC-4)细胞中的表达及生物学作用.方法利用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导bFGF-Math1基因真核表达质粒(pCI-bFGF-Math1)转染UEC-4细胞,利用RT-PCR技术检测基因在细胞中的表达,并利用免疫组织化学方法观察细胞的分化及特异性抗体的表达.结果脂质体介导的基因可在细胞内获得良好的表达,转染后24h,相差显微镜下观察细胞形态发生变化,免疫组织化学显示转染后细胞可以表达毛细胞特异性蛋白Myosin7a.结论bFGF-Math1基因有良好的生物学特性,可以有效地诱导支持细胞向毛细胞样细胞转变.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 Math1 毛细胞再生 基因治疗 -
Math1基因内耳导入后噪声性聋豚鼠听功能改变观察
目的 观察Math1基因内耳导入对噪声性聋豚鼠听功能的影响,探讨Math1基因过表达对噪声损伤耳蜗的生物学效应,为内耳基因治疗提供实验基础和理论依据.方法 经脉冲噪声致聋的豚鼠45只(各频率ABR阈值均≥95 dB SPL),雌雄不限,实验开始时体重250～300g.随机分为3组:Ad-Math1-EGFP组(30只);AdEGFP组(5只);空白组(10只).各组豚鼠在基因转导后4周、8周分别测试双耳ABR.测试完毕后处死动物,观察听泡及耳蜗无炎性病变者记录听阈结果 .结果 Math1导入后4周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳(右耳),也低于Ad-EGFP组及空白组,平均达到85 dB SPL.Math1导入后8周,导入耳各频率ABR阈值低于对照耳(右耳),也低于Ad-EGFP组及空白组,与4周时比较,进一步好转,平均达到75 dB SPL.结论 Math1基因内耳导入可使噪声导致全聋的豚鼠听功能部分恢复,为噪声性聋的治疗打开了新的思路和手段.
-
不同类型载体携带Math1-EGFP基因对293T细胞转染效率及细胞毒性的研究
目的 比较腺病毒、脂质体、纳米材料三种不同类型的载体携带目的 基因对293T细胞的转染效率及细胞毒性的大小,筛选理想的基因载体.方法 用重组腺病毒、Lipofectamine~(TM) 2000、Entranster~(TM)-D纳米材料为转染载体,携带含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的Math1-EGFP基因及真核表达质粒pRK5-Math1-EGFP,按照转染试剂盒说明优化其转染条件,分别转染293T细胞.24小时后在共聚焦显微镜下观察转染结果 并计数阳性细胞率,采用RT-PCR法检测转染细胞中Math1基因mRNA的表达,用MTT法检测不同转染条件下,不同转染载体对293T细胞的细胞毒性.结果 经优化转染条件,重组腺病毒载体转导的细胞中荧光蛋白表达几乎为95%以上,Lipofectamine~(TM) 2000、Entranster~(TM)-D纳米材料载体转染的细胞中荧光蛋白表达也分别达到70%和80%以上,而Entranste~(rTM)_-D纳米材料载体在高转染效率的剂量下仍然保持80%以上的细胞生存率.RT-PCR进一步证实,三种载体转染细胞均有Math1基因mRNA的表达.结论 Entranster~(TM)-D纳米载体作为一种新型纳米聚合物转染试剂,能成功携带内耳基因治疗关键基因Math1基因转染293T细胞,并表现了低毒、高效性能.
-
内耳相关基础研究专辑基于聚酰胺胺的非病毒载体携带Math1基因进行体外基因转导的有效性和安全性评价
目的 研发一种可用于携带Mathl基因进行基因转导的基于聚酰胺胺树枝状聚合物(PAMAM Dendrimers,PAMAM)的非病毒载体,对其转导效率和安全性进行评价,为进一步在体基因治疗奠定必要的实验基础和理论依据.方法 PAMAM(7代)通过加热活化和环糊精(Cyclodextrin,CD)表面修饰后,与pRK5-Math1-EGFP 质粒在不同氮磷比(N/P)的情况下,浮配形成基因-载体复合物,在无血清培养条件下,对HEK-293T细胞系进行体外基因转导,对其转导效率和安全性进行评价.加热活化温度设定为60℃,时间分别为:0、6、12、24、48小时；聚酰胺胺树枝状聚合物/环糊精质量比(PAMAM/CD)分别为:(1/2,1/1,4/1,8/1和无CD)；N/P分别为:1/1,2/1,5/1和10/1.通过荧光倒置显微镜观察EGFP阳性细胞并计算百分比的方法评价基因转导有效率,通过标准MTT实验评价其安全性.结果 通过60℃加热活化24小时、质量比为1/1进行环糊精表面修饰后获得的基于PAMAM的非病毒基因载体,携带pRK5-Math 1-EGFP质粒进行基因转导的效率高,达到38.14±2.85％,同时其细胞存活率达到68.86±3.44％.结论 我们获得了一种基于PAMAM的非病毒基因载体,可高效、安全地携带Math1进行基因转导,为其下一步进行在体基因转导研究奠定了必要的实验基础,有望未来应用于临床的聋病基因治疗.
关键词： 基因转导 聚酰胺胺树枝状聚合物 Math1 活化 环糊精修饰 -
Notch信号对内耳毛细胞发育的调控机制
近研究认为,Notch信号途径调节的侧抑制参与哺乳动物内耳感觉前体细胞定向分化为毛细胞和支持细胞的过程及其嵌合体的形成~([1]),在该信号途径中,使用γ-分泌酶抑制剂后,Notcb信号途径中级联反应效应被抑制,其下游转录因子Hesl和Hes5的表达减少,间接增加了Math1的表达,因而可能促进内耳毛细胞的发育.本文就Notch信号途径参与毛细胞发育的调控机制作一综述,以期对耳蜗毛细胞再生机理有更深认识.
