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胰岛素基因增强结合蛋白1基因修饰的神经干细胞向胆碱能神经元分化的实验研究
目的 探讨大鼠胰岛素基因增强结合蛋白1(Islet-1)基因是否有诱导神经干细胞(NSCs)向胆碱能运动神经元分化的能力.方法 用Islet-1基因重组逆转录病毒载体转导NSCs后,用免疫荧光组织化学染色方法检测Islet-1在NSCs内的表达;体内、体外实验观察导入Islet-1基因的NSCs向乙酰胆碱转移酶(ChAT)阳性细胞分化的情况.结果 在体外分化实验中观察到,转导Islet-1基因的NSCs向胆碱能运动神经元分化的细胞数明显多于对照组;体内移植实验发现,导入Islet-1基因的NSCs在体内可以向ChAT阳性细胞分化.结论 Islet-1基因有诱导NSCs向胆碱能运动神经元分化的能力.
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病毒预防靠病毒
异源基因转导细胞的重组病毒运载技术在各种基础与应用研究中已有几十年的历程.Darnell和同事利用重组腺病毒研究白蛋白启动子转录调控,属于早期应用实例之一[1].随着小鼠复制缺陷性反转录病毒问世,基因治疗的实验室研究进入了飞跃时期[2].该领域的研究热点为寻找各种DNA/RNA病毒载体或非病毒性载体[3-5].不久前,载体技术的思路已被引入基因疫苗的开发工作[6-10],这正是本系列综述所要涉及的主题.
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醛脱氢酶基因转导介导的K562细胞对环磷酰胺的耐受性
本研究的目的是观察经醛脱氢酶基因(ALDH1)转导的造血细胞对环磷酰胺的耐受性.以逆转录病毒载体pLXSN-ALDH1将醛脱氢酶基因导入人造血细胞系K562,应用PCR证实原病毒的整合,用RT-PCR检测ALDH1基因表达和用MTT法分析ALDH1过表达导致的4-氢过氧环磷酰胺的耐药表型.结果发现,逆转录病毒成功地介导了醛脱氢酶基因转移,全长ALDH1 cDNA以原病毒形式整合入受体K562细胞基因组,RT-PCR检测到ALDH1基因转录表达.ALDH1过表达的基因转移细胞对环磷酰胺的耐受性明显提高(4倍),IC50≈10 μmol/L.结论提示,体外ALDHl过表达足以引起对环磷酰胺耐受,为体内ALDH1基因转移以保护骨髓细胞免受环磷酰胺的毒性作用提供了实验依据.
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原代骨髓基质细胞层对逆转录病毒载体介导的造血干/祖细胞基因转导的支持效应
为探讨建立原代骨髓基质细胞层的方法并观察基质接触对造血干/祖细胞(HSC/HPC)基因转移的影响,采用Ficoll-Hypaque分离成人骨髓单个核细胞(MNC),用基质细胞培养液培养,传代4次以建立原代骨髓基质细胞层.将经细胞因子预刺激的造血干/祖细胞接种到经辐照处理的基质细胞层上,进行逆转录病毒介导的多药耐药基因(mdr1)转导,以半固体集落培养和聚合酶链反应法(PCR)检测长春新碱(VCR)抗性集落数和mdr1基因扩增片段以测定转导效率.结果表明:原代骨髓基质细胞培养传代4-6周形成混合贴壁细胞层,主要由成纤维细胞组成.集落法和PCR法检测显示基质接触能提高骨髓造血干/祖细胞基因转导效率2.1-3.3倍,对逆转录病毒介导的造血干/祖细胞基因转导具有明显的支持效应.结论:基质细胞接触联合细胞因子作用可提高逆转录病毒介导的造血干/祖细胞基因转导效率.
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IL-12基因转导EL-4细胞对C57BL/6小鼠的肿瘤疫苗作用
应用逆转录病毒构建了IL-12表达载体,以研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的肿瘤疫苗作用,将其转染EL-4胸腺瘤细胞并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果.当接种了EL-4/IL-12转染细胞后,在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的致瘤性比EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P＜0.01),在EL-4/IL-12被排斥后,体内试验中实验动物诱发了抗EL-4/Wt的系统性、保护性免疫,51Cr释放测定中,获得一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的致瘤性主要依赖于CD4+,CD8+和NK细胞.这一研究结果提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的,在未来人类癌症的治疗中IL-12亦可有一定的应用前景.
关键词： IL-12基因 EL-4胸腺瘤细胞株 肿瘤疫苗 基因转导 -
稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株的建立
本研究目的是建立稳定表达HLA-A*1101分子的K562细胞株,为研究慢性髓系白血病(CML)HLA-I限制性抗原特异T细胞的细胞毒作用提供靶细胞.利用RT-PCR从CML患者外周血单个细胞中扩增HLA-A*1101基因全长序列；利用重组PCR将2A肽连接子(D-V-E-X-N-P-G-P)基因连接到HLA-A+ 1101的3’端,并将其定向克隆入带有增强型绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-N3,构成HLA-A+ 1101-T2A-EGFP转录盒的重组表达载体；利用电穿孔技术将pEGFP-N3或重组质粒转染入K562细胞,利用荧光显微镜监测绿色荧光蛋白的表达,通过G418筛选出有效转染pEGFP-N3或HLA-A* 1101 -T2A-EGFP载体的K 562细胞株；利用RT-PCR和流式细胞术检测HLA-A* 1101基因和蛋白的表述情况.结果表明,成功构建了以2A肽基因为连接子的HLA-A* 1101-T2A-EGFP真核表达载体；重组质粒转染的K562细胞经G418筛选2个月后,获得2株表达绿色荧光蛋白的K562稳定细胞株HLA-A* 1101 +K562和pEGFP-N3+ K562.RT-PCR检测证明,HLA-A* 1101+ K562细胞表达HLA-A* 1101基因,而pEGFP-N3+ K562细胞则不表达HLA-A*1101；流式细胞术分析显示,HLA-A* 1101和GFP蛋白双阳性HLA-A*1101+K562细胞占88.5％,明显高于pEGFP-N3+ K562细胞(0.698％).结论:建立了一个简单有效地筛选HLA-A+ 1101+ K562细胞株的方法,并成功地建立了膜稳定表达HLA-A*1101蛋白的K562细胞株,为进一步研究CML的特异性细胞免疫提供工具细胞.
关键词： 慢性髓系白血病 K562细胞 HLA-A*1101 基因克隆 基因转导 -
2型重组腺相关病毒对人脐血CD34+造血干/祖细胞的转导效率研究
为探讨2型重组腺相关病毒(rAAV-2)载体能否有效地转导脐血CD34+造血干/祖细胞,采用rAAV-2/GFP感染经免疫磁珠法分离的脐血CD34+造血干/祖细胞,在荧光显微镜下观察GFP的表达.结果显示,转导19小时后感染复数(MOI)为2×105时,CD34+细胞GFP基因的表达率为43%.结论:rAAV-2能有效地转导脐血CD34+造血干/祖细胞.
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腺相关病毒载体介导造血干细胞基因转导的策略
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)已被广泛用作基因治疗的载体.本文就提高AAV载体在HSCs中的基因转导效率的策略综述如下.
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肿瘤坏死因子α基因转导的疫苗对小鼠肝癌移植瘤的影响
应用我院已构建的肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞作为免疫原,进行小鼠免疫接种,观察接种后小鼠对移植的肿瘤细胞的免疫排斥作用,探索其能否作为一种肝癌疫苗.
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人骨肉瘤细胞中sFlt-1转基因表达的测定
目的 评估sFlt-1基因针对人骨肉瘤G-292细胞体外转导的效率.方法 逆转录病毒介导的sFlt-1基因体外转染人骨肉瘤G-292细胞,应用ELISA试验评估sFlt-1转基因表达的效率.结果 sFlt-1转导后3d检测到了高水平表达,21 d时达到峰值;转基因产物较高水平的表达至少维持了8周.结论 ELISA试验测定证实sFlt-1基因体外转导成功.
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脂肪干细胞的基础研究及在泌尿外科的应用进展
脂肪源性干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是从脂肪组织中分离出的具有多方向分化能力的成体干细胞。在以往的医学研究领域中，骨髓基质干细胞（ bone marrow derived stem cells，BMSCs）一直是成体干细胞中热门的一个研究热点，但由于其具有来源较少，提取困难，提取过程对患者痛苦较大等诸多缺点，极大地限制了其在临床的应用。直到2001年，Zuk等［1］通过吸脂手术第一次从人体的脂肪中提取分离并获得了可在一定条件下分化为肌肉、软骨、脂肪、表皮，造血、神经等多种组织的ADSCs。而De Ugarte等［2］发现ADSCs与BMSCs在细胞形态、生长动力学、细胞衰减、多向分化能力及基因转导能力等方面基本相似。而ADSCs相对BMSCs具有取材方便，难度较小，对患者创伤痛苦较低的优点。因此， ADSCs已成为新的成体干细胞的研究热点。
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基因转导技术治疗心力衰竭的研究进展
慢性心力衰竭(CHF)是构成全球人口发病率和病死率的主要原因,无论在经济方面还是社会方面都给人类带来了巨大的负担.目前,虽然常规治疗方法在降低心力衰竭病死率方面有着稳定和实质性的进展,但是新的药物以及常规心脏外科手术在延长5年生存率方面并没有取得满意的临床效果.基因治疗是在上世纪70年代随着重组DNA技术的发展而引入的.幸运的是,近年来随着基于载体的基因转导策略在动物模型以及初步临床试验中的应用,基因治疗可能会为CHF提供理想的替代治疗方案.20年来,研究者针对心力衰竭基因治疗的不同基因,不同信号转导通路和不同转导方式进行了大量研究.目前CHF基因治疗的主要目的是抑制心肌细胞凋亡,并通过有效的心肌转染减少不良重塑和增加收缩力.在本文中,将总结多种心力衰竭模型中的基因转导技术,讨论这些转导策略在基于载体介导的心脏基因转导系统中的优势和不足,并着重论述基于外科方法的再循环转导技术.
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hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养和高表达株的筛选
目的:确认hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养可实现bIL-10在L02肝细胞中的高效表达.方法:通过构建真核质粒表达载体pchIL-10,并纯化后转染L02肝细胞.通过G418的压力选择获得hIL-10高表达的克隆株,并以ELISA测定其表达水平.结果:经过测序和酶切验证,真核质粒表达载体pchIL-10构建成功.电泳显示一长约540 bp条带.hIL-10基因转导可在L02肝细胞中实现hIL-10的高效表达.高表达株表达量为每小时69.875 ng/106细胞.结论:hIL-10基因修饰的L02肝细胞的克隆培养可实现hIL-10的高效表达,为抗肝纤维化、肝硬化提供有效途径.
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转导S基因的树突状细胞对肝癌患者细胞免疫的影响
目的:将乙肝病毒表面抗原基因(S基因)转导树突状细胞(DC),观察DC在体外诱导肝细胞癌患者淋巴细胞的免疫反应,探讨用基因工程方法制备的DC作为肿瘤疫苗激发特异性抗肝癌免疫作用的可行性.方法:分离7例肝细胞癌患者的DC,每例分为单纯培养组、绿色荧光蛋白基因(GFP)转导组和S基因转导组培养.用基因工程的方法构建含有S基因和GFP的重组腺相关病毒rAAV-S和rAAV-GFP,转导相应组的DC,转导成功后再诱导来自同一患者的淋巴细胞.通过IFN-γ分泌检测法测定诱导后的淋巴细胞对表达表面抗原的细胞株HepG2215的免疫杀伤情况.结果:构建的rAAV-S和rAAV-GFP分别成功的转导树突状细胞.诱导后测定S转导组、GFP转导组和单纯培养组淋巴细胞中分别有31.99±5.71%、9.90±1.53%和2.49±0.91%的细胞能够分泌INF-γ.三组结果间具有显著性差异(P＜0.01三组间的t值分别为10.99、13.49、9.88).结论:转导S基因的树突状细胞可在体外诱导出特异性细胞免疫反应.基因工程制备的DC可作为特异性肿瘤疫苗应用于肝细胞癌的免疫治疗.
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心肌基因转导研究进展
近年来,随着分子生物学的发展,人们对疾病的认识有了更深入的理解,基因转移系统日渐完善,基因治疗作为一种新的治疗策略,在多种疾病的治疗中已显示出广阔的前景.
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肌浆网钙ATP酶2a基因转导治疗心力衰竭的研究
心血管疾病和其他疾病造成的心力衰竭在世界各国影响数千万人.尽管近内外科治疗有较大的进展,但病情较重患者的5年生存率仍低于50%[1].转基因治疗作为防治心力衰竭的新思路之一,目前集中于3方面的研究:(1) 促进血管再生,改善心肌缺血,预防心力衰竭,其中与血管再生有关的生长因子VEGF和bFGF已应用于急性心肌梗死临床试验.
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骨质疏松基因治疗的研究概述
骨质疏松及其骨折严重影响老年人尤其是绝经后妇女的生活质量.除了传统治疗方法,基因治疗正成为国内外学者研究的热点.有大量文献报道了基因治疗骨质疏松的动物试验结果,如利用病毒载体局部或全身转导相关的骨诱导蛋白,以改善试验动物的骨质量,并取得了理想的结果.但其临床应用还有待进一步研究.笔者将对基因治疗骨质疏松的临床应用进行综述.
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人肝再生增强因子基因转导对大鼠肝硬化的保护作用
目的探讨人肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)基因转导对肝硬化的保护作用.方法构建hALR真核表达载体,并以肌肉注射方式转导至硫代乙酰胺诱导的大鼠肝硬化模型中,观察对肝硬化大鼠的代谢支持作用.结果构建的hALR真核表达载体pchALR肌肉注射后显著降低了血清AST、ALT、ADH水平,延长了生存时间,提高了存活率.结论人肝再生增强因子基因转导对肝硬化大鼠具有预防和治疗作用,可显著降低血清AST、ALT、ADH水平,延长生存时间,提高存活率.
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白细胞介素2基因工程人大肠癌细胞瘤苗的建立及鉴定
目的 建立高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗,并完成相关的实验室鉴定.方法 采用重组逆转录病毒将人白细胞介素2基因转导至三株人大肠癌细胞,G418筛选并挑选单克隆,ELISA检测各单克隆24 h白细胞介素2表达量,用Student Newman Keuls检验三株细胞白细胞介素2的表达差异,PCR、Southern blot检测白细胞介素2基因整合,RT-PCR、Northern blot检测白细胞介素2基因转录水平.结果 获得72株G418抗性单克隆,其中表达量高者为COLO205达138.01 ng/L×107/24 h,统计显示COLO205与SW1116、HT-29组间相比差异有统计学意义(P＜0.05),白细胞介素2基因整合至细胞基因组中,未发生重组或部分缺失,且获得成功表达.结论 本研究成功建立了高表达白细胞介素2的基因工程人大肠癌细胞瘤苗.
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体内逆转录病毒介导的sFlt-1抑制小鼠骨肉瘤生长的实验研究
目的 调查逆转录病毒介导的sFlt-1基因针对高血管内皮生长因子(VEGF)表达的人骨肉瘤G-292细胞进行体外转导的效率,并构建重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠的骨肉瘤模型,评估sFlt-1转基因治疗对于骨肉瘤生长的抑制作用.方法 2010年3月至2010年10月应用逆转录病毒介导的sFlt-1基因(sFlt-1转导组,n=10)和LacZ基因(LacZ转导组,n=10)体外转染人骨肉瘤G-292细胞(G-292组,n=10),种植到重度联合免疫缺陷小鼠胫骨近端,建立骨肉瘤动物模型.应用显微CT监测骨肉瘤的生长发育,8周后取出骨肉瘤标本进行组织学以及分子生物学分析.结果 酶联免疫吸附试验测定证实sFlt-1基因转导成功.细胞种植后2周时所有小鼠胫骨近端均出现了骨肉瘤的发生、发育,sFlt-1转导组骨肉瘤体积小于G-292组和LacZ转导组,差异无统计学意义(P＞0.05);在细胞种植后4、6、8周时,sFlt-1转导组骨肉瘤体积明显小于G-292组和LacZ转导组,差异具有统计学意义(P＜0.05).组织学表现显示了典型的骨肉瘤特征,包括重度的细胞多型现象、骨质破坏和新生血管形成.实时定量PCR测定结果显示sFlt-1转导组的sFlt-1基因相对定量表达为(4.6±1.3)倍,高于其他两组,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 逆转录病毒介导的sFlt-1基因抑制了小鼠骨肉瘤的生长.
