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纳米SiO2引起肝细胞自噬功能紊乱的研究
目的 研究纳米二氧化硅(SiO2)对肝细胞自噬功能的影响.方法 以人肝癌细胞HepG2为模型,分为对照组和SiO2处理组.用透射电子显微镜观察SiO2粒子的大小、形貌和分散性.细胞处理24 h后,透射电子显微镜观察自噬体的超微结构;激光共聚焦显微镜观察LC3B蛋白在细胞内的分布;Western blot检测SiO2不同剂量处理组中自噬标志蛋白LC3B和p62的表达水平.用自噬抑制剂氯喹预处理,检测SiO2对自噬流的影响.结果 透射电子显微镜结果显示SiNPs粒子大小均匀,形貌良好,分散性好,未发生聚集,平均粒径为58.25±7.4 nm.透射电子显微镜下观察到SiO2处理组的细胞内有大量自噬体;激光共聚焦显微镜下观察到SiO2处理组的细胞内出现LC3B的点状聚集;HepG2细胞中LC3B和p62的蛋白表达水平随SiO2处理剂量的增加而升高,并且高剂量SiO2阻断了细胞自噬流.结论 SiO2诱导HepG2细胞发生自噬,促进自噬体的产生;SiO2阻断自噬流,抑制自噬体的降解;从而导致自噬体的积累,引起肝细胞自噬功能紊乱.
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抗氧化剂和低氧诱导醌氧化还原酶1基因的表达及其机制
目的探讨低氧和抗氧化剂诱导醌氧化还原酶1(NQO1)基因表达及其与细胞增殖的关系和诱导表达的调节机制.方法人肝癌细胞SMMC-7721经抗氧化剂[酪醇(p-Ty),丁基羟茴香醚(BHA),β-萘黄酮(β-NF)]、低氧或两者共同处理24 h,分别采用微孔板测定法、RT-PCR、结晶紫显色法、电泳迁移率变动试验(EMSA)测定MQO1活力,NQO1mRNA表达,细胞增殖和细胞核蛋白与抗氧化反应元件(ARE)的结合情况.结果常氧下BHA,β-NF和p-Ty均能诱导NQO1比活力增加,酪醇诱导NQO1mRNA表达呈剂量依赖性增加,且与酶比活力存在明显的相关性;酪醇在一定范围内,其抑制细胞增殖的能力呈剂量依赖性,且细胞增殖与酶比活力存在负相关.低氧与抗氧化剂共同处理比常氧下抗氧化剂诱导NQO1比活力有增加(r=-0.41,P＜0.01).EMSA试验表明,ARE能与低氧、抗氧化剂或低氧+抗氧化剂诱导的核蛋白特异结合.结论抗氧化剂在常氧下可诱导人肝癌细胞NQO1活力增加,低氧加强其诱导能力.其中酪醇诱导NQO1活力与NQO1mRNA表达量增加相关,同时酪醇能抑制细胞的增殖,这种增殖抑制与酶活力诱导增加有关.ARE参与介导抗氧化剂和低氧诱导NQO1基因表达的调节.
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氯化镉抑瘤作用及其相关机制
目的研究氯化镉(CdCl2)对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的抑制作用及其相关机制.方法应用噻唑蓝(MTT)法CdCl2对SMMC-7721生存率的影响;流式细胞术检测对CdCl2细胞周期的影响.
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维生素E同系化合物抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用
通过探讨α-生育酚(α-T)、γ-生育酚(γ-T)、δ-生育酚(δ-T)及维生素E琥珀酸酯(VES)抑制肝癌细胞生长的生物学效应,为维生素E(VE)防治肝癌提供理论依据,在体外培养的人肝癌细胞(HepG2)培养液中分别加入12.5、25.0、50.0、100.0和200mg/L的VE同系化合物,采用细胞计数法和噻唑蓝比色法(MTT)比较VE同系化合物抑制HepG2细胞增殖的效应;采用流式细胞仪检测四种VE同系化合物对HepG2细胞周期的影响.结果显示在12.5和25.0mg/L浓度下,4种VE同系化合物均未显示出对HepG2细胞生长的抑制效应;在50、100和200mg/L浓度下,δ-生育酚、VES处理的HepG2生长速度明显减缓、细胞存活率显著降低,δ-生育酚处理的HepG2细胞生长轻度减缓,而γ-生育酚处理的HepG2细胞未见明显改变.VE同系化合物抑制HepG2细胞增殖的效应为δ-生育酚>VES>γ-生育酚>α-生育酚;细胞周期结果显示HepG2细胞增殖阻断于G1期.提示VE同系化合物抑制肝癌细胞生长作用不同,δ-生育酚和VES在体外显示出较强的抗肝癌细胞增殖效应.
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珠子参体外诱导人肝癌细胞凋亡效应及机制研究
目的:通过体外实验,观察珠子参诱导人肝癌细胞凋亡效应并初探其分子机制.方法:体外细胞培养采用人肝癌细胞株SMMC-7721,分为对照(BL)组、珠子参(PJ)组、二甲基亚砜(DMSO)组及5-FU组,采用光镜及电镜观察肝癌细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪检测肝癌细胞周期和凋亡率;RT-PCR法检测癌基因c-myc、c-fos和抑癌基因p53、p21表达的变化.结果:光镜下观察到珠子参组肿瘤细胞脱壁,有细胞出芽现象等凋亡形态改变;电镜下观察到珠子参组肿瘤细胞出现凋亡小体;珠子参组可见G0-G1期细胞聚积,阻止了细胞向S期的转换,从而干扰了SMMC-7721细胞在细胞周期中的进程,并引起细胞凋亡,DNA组方图上出现典型的凋亡峰(Apo峰),凋亡率达38.34%;RT-PCR半定量分析珠子参能降低癌基因c-myc表达(P＜0.05)和cfos表达(P＞0.05),增高抑癌基因p53、p21表达(P＜0.05).结论:珠子参能诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡,部分作用机制可能与阻滞细胞停留在G0-G1,降低癌基因c-myc和c-fos表达,增高抑癌基因p53和p21表达有关.
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沙樱桃黄酮对人肝癌细胞毒性作用研究
目的:探索沙樱桃黄酮对人肝癌细胞的毒性作用.方法:给予体外培养人肝癌细胞沙樱桃黄酮,用台盼蓝法和流式细胞仪检测其毒性作用.结果:台盼蓝法测定结果显示,给药后培养6小时,沙樱桃黄酮(0.1mg/L,0.5mg/L,5mg/L)组和5-氟尿嘧啶(5-FU)组活细胞数比对照组分别减少了34.3%、43.9%、66.8%和51.2%,到18小时减少了36.4%、52.4%、85.3%和58.2%,差异有显著性(P<0.01).流式细胞仪检测结果显示,细胞周期中G0G1、S期DNA含量明显增加,G2M期显著减少,细胞凋亡率分别为15.4%、23.4%、26.6%.结论:沙樱桃黄酮对人肝癌细胞具有明显的毒性作用,其作用与抑制细胞分裂,促进细胞凋亡有关.
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季德胜蛇药通过调控miR-335抑制肝癌Huh-7细胞增殖作用机制探讨
目的 探讨季德胜蛇药对肝癌Huh-7细胞增殖作用的影响并进一步从miRNA层面探讨其抑制增殖的调控机制.方法 以肝癌Huh-7细胞为模型,制备不同浓度的兔含药血清后培养Huh-7细胞,并同时设置相应浓度的对照组.CCK-8实验检测转染miR-335入Huh-7细胞后对该细胞增殖能力的影响;采用实时定量聚合酶链式反应qRT-PCR检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞中miR-335的调控作用;CCK-8实验检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞增殖能力的影响;Western-blot检测miR-335潜在靶向Bcl-w表达水平的变化.结果 miR-335过表达后CCK-8实验组与空白对照组及阴性对照组相比,其OD值显著降低(P<0.01).含药血清干预下,与对照组相比,同等浓度的蛇药组miR-335表达水平较高,且在一定浓度范围内含药血清浓度越高,miR-335在Huh-7细胞中的表达也相继增高;此外,CCK-8实验下季德胜蛇药含药血清组都较正常血清组OD值低,且浓度越高,其OD值越低,都有较明显的统计学差异(P<0.01).上调miR-335后,Huh-7细胞Bcl-w蛋白表达水平降低.结论 季德胜蛇药通过调控miR-335能抑制肝癌Huh-7细胞增殖.
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天螺多糖抑制HBV复制的体外实验研究
天螺多糖是我院首次以天螺(江西巴蜗牛,Bradybana.Jiangxinensis)为原料采用溶剂提取法制取的生物活性物质[1].为进一步了解天螺多糖的药理活性及其细胞毒性,我们以HBV转染的人肝癌细胞2.2.15细胞株为靶细胞,通过细胞培养实验观察其对HBV-DNA复制的抑制作用.
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复方叶下珠对人HepG 2.2.15细胞移植裸鼠HBxAg表达的影响
中药复方叶下珠是深圳市中医院肝病中心结合乙型肝炎所致肝癌和癌前病变患者临床特点,通过辨证论治、精心设计并显示有较好临床疗效的经验方.本研究选择Balb/c-nu小鼠人肝癌细胞(HepG 2.2.15)移植瘤模型,以复方叶下珠进行处理,研究造模前后裸鼠的形态学、HBxAg表达等相关指标,试图从在体动物角度,为复方叶下珠的肝癌防治作用提供试验依据.
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天佛参口服液治疗中晚期恶性肿瘤的临床与实验研究
目的：观察天佛参口服液(TFS)对中晚期恶性肿瘤的临床疗效并探讨其作用机理。方法：对用TFS治疗的71例恶性肿瘤患者按实体瘤疗效标准进行疗效分析，评定其生存质量、3年存活率及免疫功能的变化。并经实验用集落形成法测定对人胃癌(MGC803)细胞、人肝癌(SMMC7721)细胞、小鼠乳腺癌(EMT6)细胞肿瘤克隆原细胞的抑制作用和应用以上3种肿瘤染料排斥实验测定对肿瘤细胞生长率的影响。结果：临床观察71例患者总缓解率为45.1%，有效率为71.8%，生存质量改善，机体免疫力增强，治疗1、2及3年的生存率分别为78.5%、38.5%及10.8%，中位生存时间24.2个月。实验研究表明，TFS不但有直接杀伤肿瘤细胞的作用和抑制单个细胞克隆的增殖能力；并且具有广谱的抗肿瘤作用和一定的量效关系，与对照药物比较差异有显著性(P＜0.05)。结论：TFS对中晚期恶性肿瘤有明显疗效，其抗癌作用与机体免疫力增强和直接抑杀肿瘤细胞有关。
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人参皂苷Rg3对人肝癌细胞增殖、迁移、黏附和凋亡的影响及其作用机制
目的 研究人参皂苷Rg3对不同肝癌细胞增殖、迁移、黏附和调亡的影响及其作用机制.方法 以人肝癌细胞系HepG2、QGY细胞以及人成纤维细胞系HEL细胞为研究对象,运用MTT、细胞黏附、Transwell以及流式细胞仪观察Rg3对肝癌细胞的增殖、黏附、侵袭和转移以及细胞凋亡的影响;结合Western blot检测Rg3作用于HepG2和QGY细胞后CD44、VEGF蛋白的表达.结果 Rg3能特异性抑制HepG2和QGY肝癌细胞增殖、黏附、侵袭转移并显著诱导细胞凋亡(P ＜0.05);HepG2和QGY肝癌细胞暴露于Rg3后细胞中CD44和VEGF蛋白表达显著下调(P＜0.05).结论 Rg3能抑制人肝癌细胞增殖、黏附、侵袭转移并诱导细胞凋亡,其功能与CD44和VEGF蛋白表达密切相关.
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加热对人肝癌细胞-7721/Adm耐药株阿霉素的增敏作用
探讨比较阿霉素(ADM)与43℃加热单独或合并处理人肝癌细胞-7721敏感株(简称7721细胞)和人肝癌细胞-7721/Adm耐药株(简称7721/Adm细胞)的细胞毒作用.以体外培养的人肝癌细胞-7721敏感株和已经建立的人肝癌细胞-7721/Adm耐药株为研究对象,采用水浴加温法,体外细胞毒试验(MTT法),观察阿霉素(ADM)与加热处理对细胞的生长抑制的影响;采用流式细胞技术检测热处理对7721细胞和7721/Adm细胞胞内阿霉素浓度的影响.1.热处理可以明显提高两种细胞对阿霉素的敏感性:7721细胞、7721/Adm经阿霉素及43.5℃热处理,其细胞存活率分别下降35.2%(30min)、24.8%(60min)和29.4%(30min)、22.8%(60min);2.流式细胞仪检测显示热处理可明显提高这两种细胞,尤其是7721/Adm细胞内的阿霉素浓度:7721细胞组提高30.8%,HCC-7721/Adm组提高51%.热处理可以显著提高人肝癌细胞-7721敏感株和人肝癌细胞-7721/Adm耐药株对阿霉素的敏感性.
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去甲斑蝥素诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的研究
目的研究新型抗癌药物去甲斑蝥素抑制人肝癌(BEL-7402)细胞生长的机制. 方法从细胞的形态学观察和DNA琼脂糖凝胶电泳等方面考察去甲斑蝥素作用人肝癌细胞的特点,并进一步用免疫细胞化学及Western blotting等分析手段研究癌基因蛋白Bcl-2在此过程中的表达情况. 结果 10mg/L去甲斑蝥素作用人肝癌细胞24h,部分细胞出现固缩、细胞质膜突起、核染色质异常凝集等,并伴有膜包被的凋亡小体的形成.DNA琼脂糖凝胶电泳显示,处理组部分细胞的DNA已降解成以约200bp为基数的DNA片断,呈现典型的"梯状"带纹.免疫细胞化学及Western blotting分析显示该过程伴随癌基因蛋白Bcl-2表达的减弱. 结论新型抗癌药物去甲斑蝥素可以诱导人肝癌细胞发生凋亡,该凋亡过程与癌基因蛋白Bcl-2表达下调相关.
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纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究
将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞( Hep - G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯( GJIC)功能变化的影响.经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上.此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高.实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关.研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究.
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陡脉冲电场对体外人肝癌细胞SMMC-7721的诱导凋亡作用
为研究陡脉冲电场的诱导凋亡作用,以体外人肝癌细胞SMMC-7721为实验对象,采用Annexin V-FITC/PI双染色并利用流式细胞术检测磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,采用琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解片段化.实验发现,陡脉冲电场能有效(P<0.05)地使PS外翻,并且微秒级陡脉冲(μsSPEF)比纳秒级陡脉冲(nsSPEF)更有效(P<0.05);陡脉冲电场能使DNA降解片段化,且nsSPEF比μsSPEF更有效.实验结果表明,陡脉冲电场能有效诱导体外人肝癌细胞凋亡,其机理与陡脉冲电场非热效应及其频谱特性有关.μsSPEF主要作用于细胞膜,而可能通过外源性通路诱导细胞凋亡;nsSPEF主要作用于细胞核和线粒体等胞内细胞器,可能通过内源性通路诱导细胞凋亡.实验结果为陡脉冲电场杀伤肿瘤细胞的机制和参数选择提供了依据.
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艰难梭菌A毒素致细胞圆缩化和致死活性的相关性研究
艰难梭菌(Clostridium difficile)是人假膜性结肠炎和抗生素相关性腹泻的主要致病因子.其产生A、B两种与疾病有关蛋白毒素,其中由于A毒素具有肠道毒性而被认为是引起疾病的主要致病因子[1].A毒素的相对分子质量(Mr)很大,在未变性的状态下为(520～540)×103,在变性状态下降解为(220～240)×103左右,没有亚基分离.A毒素有肠道毒性、细胞毒性、小鼠致死活性、血球凝集活性、血管通透亢进等生物学活性.A毒素是一种可溶性蛋白,它通过受体介导的内吞作用进入细胞,诱导许多种哺乳动物组织和细胞发生细胞病变效应[1,2].A毒素对细胞的影响非常复杂,对A毒素的细胞毒性研究一般都是以细胞骨架变化引起的细胞形态变化即细胞圆缩化为敏感指标的,但是有报道认为细胞圆缩化后并不一定死亡[3].而国内虽然对艰难梭菌的分离、毒素精制、诊断方法及试剂方面有所研究,但还未对A毒素的细胞毒性展开工作.为此,我们采用非洲绿猴肾细胞Vero、人甲状腺乳头癌细胞TPC-1、人喉癌细胞HEP2、人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞SW1116、人肝癌细胞SMMC7721等6种细胞系,探讨了在A毒素致细胞圆缩化和细胞致死活性之间的关系.
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肿瘤坏死因子α基因转导的疫苗对小鼠肝癌移植瘤的影响
应用我院已构建的肿瘤坏死因子基因转导的人肝癌细胞作为免疫原,进行小鼠免疫接种,观察接种后小鼠对移植的肿瘤细胞的免疫排斥作用,探索其能否作为一种肝癌疫苗.
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全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选
目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定.方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮"黏附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体.结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.
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清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导SMMC-7721细胞Raf-MEK-ERK信号传导的影响
目的:观察清肝化瘀方含药血清对TGFα诱导人肝癌细胞,对Raf-MEK-ERK信号传导的影响.方法:采用血清药理学方法,以病理鼠血清作对照,用Western免疫印迹方法检测清肝化瘀方含药血清对Raf、MEK、ERK蛋白表达影响,RT-PCR方法检测清肝化,瘀方含药血清对MEK 1mRNA表达影响.结果:清肝化瘀方含药血清能抑制Raf、MEK、ERK蛋白的表达,但以抑制MEK蛋白为主(P＜0.05),能抑制MEK1 mRNA的表达(P＜0.05).结论:清肝化瘀方含药血清能够抑制TGFa诱导的人肝癌细胞增生,阻断TGFa在细胞内的信号传导.
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钙池操纵的Ca2+通道对人肝癌细胞增殖的影响
目的:对比研究人肝癌细胞与人正常肝细胞的钙池操纵的Ca2+通道(store-operated Ca2+channel,SOC)功能改变,探讨SOC对肝癌细胞增殖能力的影响.方法:培养人肝癌细胞(SMMC7721)与人正常肝细胞(HL-7702),应用膜片钳技术检测两组细胞的细胞膜SOC电流,应用激光共聚焦显微镜检测两组细胞的细胞内游离Ca2+离子浓度,应用MTT法检测两组细胞的增殖能力,应用流式细胞仪检测两组细胞的增殖周期.结果:人肝癌细胞的SOC电流密度为19.36 pA/pF±4.9 pA/pF,明显高于人正常肝细胞的电流密度8.90 pA/pF±2.78 pA/pF;人肝癌细胞的细胞内钙荧光强度增加31.81％±8.89％,明显高于人正常肝细胞的21.58％±6.01％; MTT生长曲线显示从第3天开始,人肝癌细胞的增殖能力明显高于人正常肝细胞,且时间越长,增殖能力差别越大；流式细胞仪研究提示人肝癌细胞的S期细胞比例(S-phase cells ratio,SPF)、增殖指数(proliferation index,PI)明显大于人正常肝细胞,从而提示人肝癌细胞的增殖能力明显高于人肝细胞.结论:与人正常肝细胞相比,人肝癌细胞的SOC电流密度增大、细胞内游离Ca2+浓度升高、增殖能力增强,提示人肝癌细胞增殖能力提高与其SOC功能增强有关.
