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冠心病病人载脂蛋白E与血脂水平的相关性
人类载脂蛋白E(apo E)有三种主要异构体E2、E3、E4,是由三个等位基因编码,不同的apo E异构体受体结合活性不同,从而影响了脂蛋白的代谢,出现异常的脂蛋白血症.本实验研究探讨天津地区汉族人群apo E等位基因的频率分布及对血脂水平的影响,分析正常人与冠心病病人apo E基因分布频率的差异.
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人源抗HER2单链抗体/鱼精蛋白截短体融合蛋白的表达、纯化及鉴定
在人类乳腺癌组织中人类表皮生长因子受体2 (HER2)和受体趋化因子4(CXCR4)的表达成正相关,由于HER2与CXCR4/CXCL-12轴在乳腺癌骨转移中的重要作用,使其成为可供选择的肿瘤治疗靶点.本研究将HER2单链抗体(ScFv)与鱼精蛋白截短体(tP)融合,以期获得同时具有抗原与核酸结合活性的ScFv-tP融合蛋白,核酸与该融合蛋白结合后,有望实现小分子干扰RNA( siRNA)的靶向递送,对HER2与CXCR4/CXCL-12轴进行RNA干扰(RNAi),为新型抗肿瘤药物应用于临床提供资料.
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重组抗HBsAg单链抗体在HBV转基因小鼠体内作用的研究
目的研究重组人源抗HBsAg单链抗体(HBscFv)在HBV转基因小鼠体内的活性作用,探讨HBV转基因小鼠作为HBsAg特异性抗体的结合活性评价模型的可行性.方法工程菌表达的HBscFv包涵体经固定化金属螯合层析和分子排阻层析两步纯化后,分步透析复性.复性后的HBscFv(0.9g/L)经尾静脉注射HBV转基因小鼠,一定时间后测定鼠血清中HBsAg的浓度,计算抗体注射前后HBsAg浓度下降的百分比(结合率),同时以人血源HBsAb IgG(40U/ml)和生理盐水作为对照.结果两步纯化获得纯度达到98%的重组HBscFv.HBscFv制品能够结合转基因小鼠体内的HBsAg,其结合率为(30.47±9.85)%,与生理盐水组差异有显著性(P<0.001),与HBsAb IgG组差异无显著性(P>0.05);对照品HBsAb IgG的结合率为(39.00±7.43)%,与生理盐水组差异也有显著性(P<0.001).比较HBscFv和HBsAb IgG的结合率及其浓度,求得HBscFv的结合效价为31.58U/mg.结论 HBscFv在转基因小鼠体内具有特异性结合HBsAg活性,HBV转基因小鼠可发展为评价HBsAg特异性抗体的体内结合活性的候选模型.
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丹参对TGF-β1刺激的NIH/3T3细胞c-fos mRNA表达和AP1蛋白结合活性的影响
目的:研究丹参对TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞功能的影响.方法:将正常大鼠进行丹参灌胃,分离含药血清,温育TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞.RT-PCR法检测c-fos基因表达,Gel mobility shift assay法检测AP1蛋白的结合活性.结果:经TGFβ1刺激后,细胞c-fos mRNA表达及AP1蛋白结合活性明显增强,丹参含药血清可分别抑制由TGFβ1引起的细胞c-fos mRNA表达及AP1蛋白结合活性的增强.结论:丹参可以抑制TGFβ1刺激的NIH/3T3成纤维细胞中的c-fos基因表达及AP1蛋白结合活性.
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全人源肝癌噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选
目的:对全人源肝癌噬菌体单链抗体库进行鉴定,筛选肝癌抗体,同时对抗体的活性进行鉴定.方法:PCR鉴定阳性重组菌TG1中人肝癌ScFv的插入率.先以人成纤维细胞黏附后再以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行3轮"黏附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定;通过ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.结果:ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮得到提高,第3轮为第1轮的214倍.筛选后的ScFv进行PCR鉴定及双酶切鉴定后,均可检测到目的基因.得到3株特异性肝癌单链抗体.结论:利用噬菌体抗体库技术结合减数筛选得到了肝癌噬菌体单链抗体及其基因,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.
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特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中的表达、纯化及生物学活性鉴定
目的:实现特异性抗肝癌单链抗体二聚体在毕赤酵母中高效表达、纯化并鉴定其生物学活性.方法:构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,转化感受态大肠杆菌DH5α,选择测序正确的阳性克隆进行扩增后,电转化酵母细胞,表达抗体二聚体,对表达抗体进行纯化、浓度检测,并鉴定其对肝癌细胞的结合活性,免疫组织化学检测二聚体对肝癌组织抗原的特异性.结果:测序显示成功构建酵母表达载体pGAPZαA-BDM,表达96 h抗体收获量大,二聚体表达量为30 mg/L菌液,为大肠杆菌的300倍.抗肝癌单链抗体二聚体BDM与三种肝癌细胞结合,而与正常肝细胞不结合,结合效价为1:128.免疫组织化学显示二聚体与肝癌组织结合的阳性率比肝硬化、胃癌、正常肝组织高,差异有统计学意义.结论:成功制备了高表达量、高特异性、较好的活性及稳定性的抗肝癌单链抗体二聚体BDM,为制备免疫纳米颗粒及开展肝癌的放射免疫诊断和靶向治疗奠定了基础.
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IκB激酶在肝脏缺血再灌注中的作用
目的:探讨IκB激酶(IKK)在肝脏缺血再灌注(HIR)中的作用.方法:Wister大鼠随机分为对照组、缺血再灌注组(HIR组)、PDTC保护组(HIR+PDT组).HIR组将肝左叶及肝中叶入肝血流阻断60min后再灌注.保护组先经阴茎背静脉注射PDTC 120 mg/kg-1后立即依HIR组致伤,对照组仅显露肝中叶及肝左叶肝蒂,不阻断,自阴茎背静脉注射无菌生理盐水1 mL.分别采用原位杂交、EMSA、免疫组化及赖氏法检测再灌注后1、6、12 h IκB激酶表达、NF-κB活性、TNF-α的表达及血浆中ALT含量.结果:损伤后IκB激酶表达水平、NF-κB结合活性、TNF-α表达水平、血浆中ALT含量升高;HIR+PDTC组与HIR组相比较,IκB激酶表达水平、NF-κB活性、TNF-α表达水平、血浆ALT水平降低.结论:HIR后肝内IκB激酶可促进NF-κB的高水平激活引起肝内TNF-α等炎症相关细胞因子表达增强,从而导致肝脏损伤.干预IKK-NF-κB通路可能是防止HIR后急性肝脏损伤发生、发展的一个有效途径.
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复方利肝冲剂药物血清对肝星状细胞NF-KB结合活性的抑制作用
目的:研究复方利肝冲剂对肝星状细胞NF-κB结合活性的影响,探讨复方利肝中剂抗肝纤维化的主要作用机制.方法:复方利肝冲剂药物血清与鼠肝星状细胞共孵育48h后,NF-kB结合活性的检测采用凝胶电泳移动抑制法,细胞培养液中细胞因子的检测采用ELISA去,细胞凋亡和细胞增殖分别采用流式细胞术和3H-TdR掺入法检测结果:复方利肝中剂药物血清使长外培养的鼠肝星状细胞NFkB结合活性比无药血清对照组显著减弱(图1),细胞培养液中的IL-6和sJCAM水平降低(1.56±0.42ng·L-1vs3.64±0.58ng·L-1.P<0.05;3 82±0.98ng·L-1vs12.64±1.22ng·L-1,P<0.01)星状细胞凋亡增加24.8%± 3.60%vs6.6%± 1.2%,P<0.01,增殖减少2623±654/孔vs5061±346/孔,P<0.01.结论:复方利肝中剂显著抑制体外培养的肝星状细胞NF-κB结合活性,可能为其抗纤维化的重要机制之一.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定
目的:制备抗丙型肝炎病毒(HCV)包膜蛋白E2(E2)的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗-Id scFv),为研制HCV E2的抗-Id scFv疫苗奠定基础.方法:采用噬菌体表面展示技术,将抗HCV E2单克隆抗体固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出53个克隆,利用酶联免疫黏附法、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCV E2单克隆抗体结合活性较强的抗独特型抗体单链可变区片段(抗-IdscFv)的阳性克隆,并对HCV E2特异性抗-Id scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了12倍.用酶联免疫黏附实验(ELISA)方法测定第五轮筛选后上清液中含有的抗-Id scFv与HCV E2单克隆抗体结合活性.其中有18株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(E11 A450 nm 0.928,E14 A450 nm 1.152,E17 A450 nm 1.136,E28 A450 nm 1.163,E53 A450 nm0.965).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有5株交叉反应较弱(E11 A450nm 0.044,E14 A450 nm 0.062,E17 A450 nm 0.166,E28 A450nm 0.012,E53 A450 nm 0.069),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(E28)阳性克隆提取质粒,进行DNA序列测定,DNA大小为768bp.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得单抗HCV E2的抗-Id scFv,本实验结果为开展用抗-Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件.
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长春新碱诱导人胃癌耐药细胞表达P-糖蛋白由核因子-κB活化调控
目的:研究核因子-Kappa B(NF-κB)在胃癌长春新碱耐药细胞中的活化情况,及其对细胞膜P-糖蛋白(P-gp)表达的调控作用.方法:以胃癌细胞SGC7901及其长春新碱(VCR)耐药株SGC7901/VCR为研究对象.采用凝胶电泳迁移率分析检测NF-κB DNA结合活性,细胞-ELISA法检测细胞内IκB-α蛋白和细胞膜P-糖蛋白(P-gp)的表达,免疫细胞化学法观测细胞内P65核转位.结果:SGC7901/VCR耐药细胞中NF-kB的基础活性比敏感细胞高1.4倍.不同浓度VCR(5,10,20,50 μg/L)均可引起耐药细胞NF-κB DNA结合活性增强、Iκ3-α蛋白表达下降和P-gp表达增强,而亲本敏感细胞产生的上述效应均不及耐药细胞明显;SGC7901/VCR耐药细胞中,NF-κB活性与P-gp的表达呈正相关(r=0.977,P<0.01),且NF-κB活化的同时伴有P65核转位.NF-κB抑制剂MG-132可抑制VCR诱导的NF-κB活化及IкB-α降解,同时还能抑制P-gp高表达.结论:胃癌长春新碱耐药细胞中NF-кB活性增强,可能参与调控VCR诱导的细胞膜P-gp高表达.
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Stat3反义寡核苷酸对人胃腺癌MKN45细胞相关信号传导影响的研究
目的:通过研究Stat3反义寡核苷酸对人胃腺癌MKN45细胞增生活性的影响,寻求胃癌治疗中相关信号传导途径的新靶点.方法:Stat3反义寡核苷酸是一种混合骨架寡核苷酸(MBO),采用脂质体介导的方式将其转染人胃腺癌细胞株MKN45;通过MTT法观察转染前后对细胞增生状态的影响;凝胶阻滞电泳(EMSA)和Western blot方法观察转染前后Stat3DNA的结合活性和磷酸化Stat3蛋白表达的变化.结果:Stat3反义寡核苷酸对MKN45细胞的增生有明显抑制作用;转染反义寡核苷酸后MKN45细胞中Stat3信号的组成性激活水平和磷酸化Stat3蛋白的表达分别下降了50.65%及78.86%.结论:Stat3反义寡核苷酸能显著抑制MKN45细胞中Stat3信号的传导,胃癌细胞株中活化的Stat3信号可作为胃癌治疗新的分子靶点.
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载脂蛋白E基因多态性与老年人心肌梗死及血脂的相关分析
高脂血症是心肌梗死发生的重要危险因素之一,严重危害老年人的健康。载脂蛋白E(apoE)作为脂蛋白的结构与功能蛋白,其不同异构体与受体的结合活性有较大差异,从而对血脂、脂蛋白水平产生不同影响。我们应用分子生物学方法,分析apoE基因多态性对老年MI发生与血脂水平的相关性意义。
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特发性肾病综合征患者外周血单个核细胞糖皮质激素受体、核因子κB及活化蛋白-1的检测
糖皮质激素(以下简称激素)是治疗特发性肾病综合征(INS)的首选药物,但部分患者会出现激素抵抗 [1].原发性激素抵抗有遗传家族史,继发性激素抵抗的发病机制目前尚不完全清楚,可能与糖皮质激素受体(GR)及某些炎症相关转录因子[核因子κB(NF-κB)、活化蛋白-1(AP-1)等]的活性异常有关 [2].本研究通过观察INS患者激素治疗前及治疗过程中外周血单个核细胞 (PBMC)NF-κB、AP-1和GR DNA结合活性的变化,及其与INS激素敏感性的关系,探讨INS 患者激素抵抗的机制.
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丹参对大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区AP-1 DNA结合活性的影响
近来研究表明,AP-1作为一种转录因子,可被短暂性全脑缺血激活,与缺血性脑损伤机制有关.丹参(radix salviae miltiorrzhizae,RSM)为防治缺血性脑血管病的常用中药,其药理作用已有许多报道,如丹参可改善微循环、增加脑组织ATP含量、减轻缺血引起的脑水肿,部分抑制缺血后脑组织c-fos基因的表达、拮抗缺血后脑组织的单胺类介质、兴奋性氨基酸的异常变化等.但丹参对脑缺血再灌后转录因子DNA结合活性的影响报道较少.
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非激动剂PPARγ配体的筛选方法建立和应用
建立体外活性评价方法考察化合物对过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)转录激活活性和结合活性.首先通过质粒构建,分别建立PPARγ反应原件(PPARγ response element,PPRE)介导报告基因表达的转录激活筛选方法以及PPARγ配体结合区(ligand binding domain,LBD) 与酵母转录激活因子Gal4组成的嵌合受体在细胞水平的结合活性筛选方法.并采用基于时间分辨-荧光共振能量转移(time resolved-fluorescence resonance energy transfer,TR-FRET)技术的PPARγ竞争性结合检测方法,考察化合物或药物对PPARγ的亲和力.采用以上3种不同的体外活性评价方法,评价不同PPARγ配体的效能和作用特点,并发现了一个新的苯磺酰胺衍生化合物,ZLJ01,具有类似于已知PPARγ激动剂的结合活性及亲和力,但无PPRE介导的转录激活活性.初步体外降糖活性检测发现,ZLJ01可促进肝细胞胰岛素依赖的葡萄糖摄取.综上所述,结合转录激活活性和亲和力的评价方法,可用于筛选非激动剂PPARγ配体,以发现新型PPARγ调节剂.
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无毒棉花籽中黄酮苷化学成分的研究
无毒棉花籽为农作物棉花(锦葵科Malvaceae,棉属Cossypium L.)经选育得到的含低量棉酚的变种棉花的种子[1].文献曾报道无毒棉花子的水提物有较强的5HT受体结合活性[2].为寻找生物活性成分,笔者对无毒棉花籽进行了化学成分的研究.采用聚酰胺色谱技术的分离方法,从中分得4个黄酮苷,经光谱数据鉴定,分别为山柰酚-3-O-β-D-芹菜糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖(1→6)]-β-D-葡糖苷(Ⅰ)、槲皮素-3-O-β-D-芹菜糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖(1→6)]-β-D-葡糖苷(Ⅱ)、山柰酚-3-O-β-D-芹菜糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖(1→6)]-β-D-葡糖苷(Ⅲ)及槲皮素-3-O-β-芹菜糖-(1→2)-β-D-葡糖苷(Ⅳ).其中化合物Ⅲ为山柰酚型黄酮苷,为首次从该属植物中分得.
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大鼠重组EPO结合蛋白的表达纯化及活性鉴定
EPO是调控骨髓红系造血的关键因子,其与红系祖细胞表面的特异受体EPO-R结合引发胞内信号机制,防止细胞凋亡并促进其增殖和分化[1].EPO-R胞外域是与EPO发生结合的受体区段,又称为EPO结合蛋白(EBP).迄今,采用基因工程方法制备的EBP主要被应用于受体-配体结合特性及物理结构研究[2-4],其在治疗EPO反应性增生失调如红白血病和红细胞增多症中的可能性探讨尚未见报道.我们依据EPO-R与EPO结合的化学计量特性设计了串联融合的双体结合蛋白,采用原核系统进行表达,对其体内外结合活性进行了鉴定.
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凝胶滞留法测定铁调节蛋白结合活性方法的建立
细胞铁代谢的自稳态是维持正常细胞功能的关键环节,转铁蛋白受体(TfR)和铁蛋白(Fn)在控制铁的摄取、贮存过程中起重要作用, 这两种蛋白的表达存在一种转录后调节机制,胞浆中的铁调节蛋白(IRP)可与存在于TfR、Fn 3′端或5′端非翻译区(UTR)的铁反应元件(IRE)结合,控制TfR、Fn的表达.目前的研究结果表明,除细胞内铁水平外,其它因素,如一氧化氮(NO)、H2O2、细胞增殖或分化、缺氧等均可影响IRP与IRE的结合活性,从而调节细胞铁代谢[1-3].我们旨在建立铁调节蛋白结合活性的测定方法,为铁代谢研究打下方法学基础.
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选择蛋白及其配体与肿瘤转移
选择蛋白(selectin)是细胞黏附分子中的一个家族,包括3个成员:L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白.选择蛋白分子具有糖链结合活性,能通过其分子中的凝集素样结构域与糖蛋白、糖脂或蛋白多糖上的糖配体(ligand)特异结合,在炎症发生时介导白细胞与血管内皮间的起始黏附,在淋巴组织中介导淋巴细胞的归巢,乃至在肿瘤的转移过程中发挥作用.另外,选择蛋白及其配体也可作为信号分子促进肿瘤的转移.因此,通过抑制选择蛋白与其配体的相互作用,或阻断选择蛋白的表达,可以作为防治肿瘤转移的一条重要思路.本研究就选择蛋白及其配体的分子结构、功能特点与肿瘤转移的相关性作一综述.