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人源化单链抗体与白细胞介素2融合蛋白靶向治疗肿瘤的实验研究
目的 评价人源化抗Her2/neu单链抗体及人白细胞介素2(hIL-2)双功能融合蛋白H520C9scFv-hIL-2治疗Her2/neu阳性肿瘤的效果.方法 将构建的表达载体转染293细胞,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系.免疫印迹法(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及[3H]脱氧胸苷(3H-TdR)渗入法检测融合蛋白浓度和生物学活性.建立荷瘤小鼠肿瘤模型,静脉给药,观测肿瘤体积变化判断治疗效果.结果 细胞培养上清中融合蛋白浓度达(1.2±0.23)mmol/L,5μl上清即可在46 000处见到清晰蛋白条带.纯化后的融合蛋白两个功能单位活性良好,在荷瘤小鼠肿瘤模型治疗实验中显示了明确的治疗效果.结论 哺乳动物细胞可高效表达生物活性良好的融合蛋白H520C9scFv-hIL-2,该蛋白在体内实验中有明显的抑瘤作用,显示了较好的应用前景.
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抗血小板人源化抗体的研究进展
血小板在出血和血栓性疾病中发挥着重要作用.抗血小板人源化抗体在治疗特发性血小板减少性紫癜和防止血栓性疾病方面有极大的临床应用价值.本文就血小板在出血和血栓性疾病中的作用,人源化抗体的发展现状和抗血小板人源化抗体在出血性及血栓性疾病中的应用作一综述.
关键词: 抗血小板自身抗体 人源化 特发性血小板减少性紫癜 血栓性疾病 -
抗人纤维蛋白单链抗体重链可变区的人源化
目的 人源化抗人纤维蛋白单链抗体的重链,降低人抗鼠抗体反应. 方法 从基因文库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体重链(VH-8E5)同源性71.8%的人源免疫球蛋白HUMHCH109重链(VH )序列,作为人源化改造VH-8E5的框架.人工合成人源化VH-8E5片段,用连接酶连接成完整的人源化VH-8E5,构建表达载体pOPE101-VH-8E5.转化JM109后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达. 结果 经聚丙烯酰胺电泳和ELISA证明表达产物相对分子质量30×103左右,有特异性识别和结合人纤维蛋白能力,是亲本抗体ScFv-8E5活性的4/5左右.人源化ScFv-8E5表达产量为转化菌总蛋白的11.2% . 结论 人源化VH-8E5仍具有特异性识别人纤维蛋白的活性,ScFv-8E5重链的人源化基本获得成功.
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抗体库优化策略对特异性抗肝癌单链抗体的人源化
目的:对特异性抗肝癌单链抗体(single chain variable fragment,scFv)DM同步进行人源化和优化,以获得亲和力高和免疫原性低的人源化抗肝癌单链抗体.方法:通过分子结构和序列分析,确定对抗原结合位点的构象有重要影响的骨架区(FR)残基,把难以判断回复突变残基的人、鼠源副本同时编入人源化抗体序列中;通过重叠延伸PCR技术合成人源化抗体全基因,利用噬茵体展示技术构建人源化组合抗体库;通过肝癌细胞筛选阳性克隆,ELISA方法测定各个克隆抗原结合活性;用硫氰酸盐洗脱法测定并比较亲本抗体和人源化scFv的相对亲和力.结果:成功构建人源化组合抗体库,实际库容4.77×10 5,包含由2 5不同重链和2 2不同轻链组成的128种人源化DM;经过筛淘及ELISA鉴定,获得HDM1、HDM2和HDM3 3个阳性克隆,相对亲和力指数分别为HDM1 1.6 mol/L、HDM2 1.2 mol/L和HDM3 2.2 mol/L.结论:抗体库优化法是一个高效、简便的人源化方法;获得的3株阳性克隆HDM1、HDM2、HDM3与亲本抗体DM同样具有良好的抗原结合特异性和较高的亲和力.
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抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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抗肝癌人源化单链抗体hscFv25的体外亲和力成熟
目的:提高人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的亲和力.方法:设计并合成人源化抗肝癌单链抗体hscFv25重链及轻链CDR3的半随机突变引物,构建突变体抗体库,竞争筛选亲和力更高的突变体抗体,对所得到的高亲和力的候选抗体,在大肠杆菌中进行可溶性表达,并采用细胞ELISA、细胞涂片免疫组织化学染色的方法,对该抗体进行初步的活性鉴定.结果:得到了3株候选高亲和力突变体抗体,其中的一株在大肠杆菌中获得了可溶性表达后,进一步的活性检测结果表明,该抗体的相对亲和力比亲本单链抗体提高了60倍左右,同时该抗体对肝癌细胞(SMMC-7721)的免疫组织化学染色呈强阳性,着色情况与亲本抗体相一致,而对正常肝细胞(HL-02)染色呈阴性.结论:成功地构建了人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的突变体抗体库,并筛选到了一株亲和力更高的突变体抗体.
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人源性细胞大鼠体内移植的实验研究
骨髓内存在能够向肝细胞分化的干细胞的事实已被广泛接受.然而,骨髓源性肝干细胞还不能作为生物人工肝以及肝细胞移植的细胞来源进行临床应用.主要的原因是难以通过骨髓源性干细胞获取足够数量的肝细胞.本实验通过建立肝损伤的大鼠体内微环境,将人骨髓干细胞和人肝细胞系CL-1细胞移植到大鼠肝脏内,试图实现动物肝脏人肝细胞化,获取足够的人源化肝细胞,为临床肝脏移植和生物人工肝治疗提供新的思路.
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模拟卵巢癌抗原的人源化抗独特型抗体的构建与表达
目的对模拟人卵巢癌抗原的鼠源性抗独特型单链抗体6B11scFv进行人源化改造和表达.方法采用重叠PCR和基因工程技术,将6B11scFv基因与人IgG1铰链区和CH3区的基因进行融合,构建人源化抗独特型抗体6B11VHVLhC基因.用IPTG诱导大肠杆菌进行表达,并采用酶切法、DNA测序、SDS-PAGE电泳、ELISA和免疫印迹技术等进行鉴定.结果酶切和DNA测序表明插入片段正确;SDS-PAGE凝胶电泳显示融合蛋白分子量50 000 Da处有一诱导蛋白带;而不连续非变性凝胶电泳表达产物分子量为100000 Da;ELISA和免疫印迹结果显示,表达出的6B11VHVLhC人源化抗体仍具有6B11scFv和人IgG1CH3的活性.结论已成功构建并表达出双价的可模拟卵巢癌抗原的人源化抗独特型抗体.
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兔眼结膜下注射雷珠单克隆抗体的视网膜渗透研究
目的 探讨兔眼结膜下注射雷珠单克隆抗体(ranibizumab)是否可以渗透进入视网膜.方法 实验研究.56只新西兰大白兔随机分为4个组:空白对照组(3只)、结膜下注射生理盐水组(3只)、结膜下注射雷珠单克隆抗体组(25只)及玻璃体腔注射雷珠单克隆抗体组(25只),均取右眼进行注射.在注射后1、2、4、8、12周时分别用ELISA和免疫荧光的方法检测兔眼房水中的药物浓度和视网膜中的药物定位情况.药物浓度数据的比较采用t检验.结果 玻璃体腔注射雷珠单克隆抗体组注射后1、2、4、8、12周房水中药物浓度分别为(389.67±22.55)、(319.33±17.93)、(22.67±3.06)、(9.67±1.53)、(7.33±2.18)mg/L.结膜下注射雷珠单克隆抗体组注射后1、2、4、8周房水中药物浓度分别为(53.67±3.21)、(12.67±3.06)、(8.33±1.53)、(2.66±2.08) mg/L,各时间点药物浓度均与玻璃体腔注射组有统计学差异(t=32.96,38.39,7.67,11.07,P<0.05);12周时房水中未检测到雷珠单克隆抗体.视网膜免疫荧光检查结果与上述结果类似,在结膜下注射组中,只有12周时检测不到雷珠单克隆抗体的阳性信号.结论 雷珠单克隆抗体可以通过结膜下注射的给药方式渗透至视网膜.
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关注湿性年龄相关性黄斑变性抗血管内皮生长因子治疗中的无应答病例
抗VEGF药物已经成为湿性AMD患者的一线标准用药,但是仍有部分患者治疗后出现无应答,其原因目前仍不确切,但可能与AMD的类型、黄斑区解剖因素异常、遗传基因型的不同、AMD病变的程度及抗药反应有关。眼科医师应当关注这部分无应答病例并给予正确的处理,大限度地避免抗VEGF药物的滥用,并积极探索适合患者佳个性化治疗措施。(中华眼科杂志,2014,50:406-410)
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新型人源化抗CD20单克隆抗体的表达和活性检测
目的:制备新型人源化抗CD20单克隆抗体并检测其与CD20抗原的亲和力和抗肿瘤活性。方法通过计算机模建技术,在蛋白质结构数据库中找到与利妥昔单抗( rituximab)空间结构相近的人IgG1为骨架,将利妥昔单抗的互补决定区( complementarity determining region ,CDR)进行移植和改造,通过重叠PCR方法,扩增出目的基因片段。分别将轻链(L)、重链(H)基因片段克隆到载体pcDNA3.3、pOptiVEC质粒上。瞬时转染至293F细胞,收取细胞上清,用rProteinA亲和层析法纯化目的抗体,并用十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检验抗体的纯度和表达量,采用Fortebio技术检测抗体与抗原的结合能力,后通过裸鼠移植瘤生长抑制实验检测抗体的抗肿瘤活性。结果构建了3种抗CD20人源化抗体。抗体在还原SDS-PAGE中表现为两条相对分子质量约为25×103和55×103的条带,与预计条带大小相符;Fortebio实验结果表明,3组抗体与抗原具有良好的亲和活性:利妥昔单抗、L4H7抗体、L5H5抗体和L5H7抗体的Kd值分别为6.48×10-9、1.91×10-9、7.35×10-10和1.91×10-9 mol/L。裸鼠移植瘤生长抑制实验表明,L5H7抗体的抗肿瘤活性优于利妥昔单抗。结论成功构建并表达了3种抗CD20人源化抗体,其中L5H7抗体具有良好的抗原结合能力和抗肿瘤活性。
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reslizumab用于严重哮喘患者维持治疗
FDA于2016年3月批准TEVA公司的reslizumab(Cinqair)与其他哮喘药物联合用于≥18岁严重哮喘患者维持治疗。reslizumab是一种人源化IL-5拮抗剂单克隆抗体,在小鼠骨髓瘤细胞中通过重组DNA技术产生,通过降低血中嗜酸粒细胞水平而减少严重哮喘发作。该药静脉注射的推荐剂量为3 mg/kg,每4周一次,持续输注20~50 min。
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贝伐珠单抗用于多形性胶质母细胞瘤一线治疗不具有经济性
研究背景及临床问题丨多形性胶质母细胞瘤(GBM)是一种罕见但侵袭性强的脑肿瘤,治疗选择少且患者治疗结局差。贝伐珠单抗是一种作用于血管内皮生长因子的人源化单抗,可用于多种肿瘤,发挥抗血管生成的作用。2009年,美国食品药品管理局已批准贝伐珠单抗用于复发性GBM的二线治疗,近的研究数据也表明,在GBM —线治疗中,与安慰剂相比,贝伐珠单抗联合GBM标准治疗虽然未能延长患者总生存期(OS),但可显著延长患者的无进展生存期(PFS ),因此,未来贝伐珠单抗有可能用于GBM的一线治疗,但这一新的干预措施是否具有经济性尚属未知。
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新一代治疗抗体的研究进展
单抗(mAbs)目前是一类公认的治疗药物,有许多产品经批准上市用于诊断和治疗多种疾病,包括自身免疫疾病、移植排异反应、心血管疾病、炎性疾病、感染性疾病和肿瘤等,并且还存在巨大的发展空间.尽管其作为治疗制剂有着明显的优势,但是,常规抗体也具有明显的局限性.第一,它是大的和结构复杂的蛋白.首先,按照分子量标准,抗体属超大分子的物质,每个分子含有两条重蛋白链和两条轻链,并与糖分子杂乱地重叠在一起.由于其大分子特性,难以达到深藏于组织或膜中的靶.其次,由于其结构复杂,合成单抗之前通常需要从大鼠体内分离出抗体,然后进行人源化.人源化的过程非常复杂,需向鼠源性抗体中嵌入人体基因,编译出与人抗体的氨基酸序列相同的蛋白质片段,部分或全部取代鼠源性抗体中的蛋白.
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贝伐珠单抗说明书中新增卵巢衰竭、下颌骨坏死和静脉血栓栓塞的风险提示
2011年10月4日,美国食品和药品管理局(FDA)发布公告,要求在贝伐珠单抗(bevacizumab)的说明书中增加卵巢衰竭、下颌骨坏死和静脉血栓栓塞的风险提示[1].贝伐珠单抗为重组的人源化IgG1单克隆抗体,可与血管内皮生长因子(VEGF)结合,阻碍VEGF与其受体在内皮细胞表面相互作用.主要用于治疗大肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌.不良反应主要有高血压、出血、胃肠道穿孔、充血性心力衰竭和肾病综合征等[2].
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抗体导向抗肿瘤药--吉妥珠单抗奥唑米星
抗体导向化疗(antibody-targeted chemotherapy,ATC)是近年来治疗肿瘤的新方法,它使抗肿瘤药物直接靶向递入到恶性细胞,因此疗效提高,不良反应降低[1].吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin,CMA-676)是一种抗体导向抗肿瘤药,由重组人源化IgG4单克隆抗体(吉妥珠单抗,hP67.6)与细胞毒抗肿瘤抗生素刺孢霉素(calicheamicin)联结而成,商品名为Mylotarg[2].2000年5月美国FDA批准Mylotarg上市,吉妥珠单抗奥唑米星的化学结构式如图1.
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Mepolizumab 用于嗜酸粒细胞性哮喘的两项芋期临床试验取得满意结果
英国葛兰素史克( Glaxosmithkline )公司于2014年3月12日宣布,其在研药物 Mepolizumab (参考译名:美泊利单抗)用于严重嗜酸粒细胞性哮喘的两项芋期临床试验取得满意结果。
Mepolizumab 为全人源化免疫球蛋白1单克隆抗体,可与白细胞介素-5( IL-5)靶向结合。 IL-5调节嗜酸粒细胞的生长、活化、存活,并为嗜酸粒细胞从骨髓迁移至肺部提供重要信号。Mepolizumab与 IL-5结合,可阻断其与嗜酸粒细胞表面受体结合,从而降低血液、组织及唾液中嗜酸粒细胞水平。 -
利妥昔单抗联合CHOP方案治疗淋巴瘤并发致死性暴发性乙型肝炎2例报告并文献复习
绝大多数B淋巴细胞表达CD20抗原,人源化的CD20单抗--利妥昔单抗注射液(美罗华)可通过细胞毒和诱导凋亡的作用,特异性杀灭淋巴瘤细胞和正常的B淋巴细胞,它的不良反应轻微,通常局限于输注过程中,并不增加机会感染的发病率.