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人同源异形盒基因HOXB9多克隆抗体的制备和活性鉴定
目的 制备兔抗人同源异形盒基因HOXB9的多克隆抗体,为后续深入研究HOXB9蛋白的功能提供工具.方法 采用聚合酶链反应(PCR)和DNA重组技术,构建HOXB9基因5’端7458碱基片段到原核表达载体pGEX-4T-1和pMal-C2x中,热休克法转化及异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达谷胱甘肽转移酶标签的HOXB9 N端融合蛋白和麦芽糖结合蛋白标签的HOXB9 N端融合蛋白.纯化GST-HOXB9 N端融合蛋白免疫新西兰白兔,ELISA鉴定效价后,颈动脉放血,收集血清,纯化抗体.免疫印迹法及免疫沉淀法鉴定抗体有效性及特异性.结果 本实验制备的抗体能够特异识别目标分子的单一条带,并且具有较强的免疫沉淀天然构象的HOXB9蛋白的能力;采用所制备的抗体检测发现,HOXB9蛋白在小鼠免疫器官、胰脏、结肠、肺、小脑、雌性生殖系统及睾丸中表达较高,其他器官表达较低或无表达.结论 成功制备了特异而有效的兔抗人HOXB9蛋白多克隆抗体,此多克隆抗体可用于免疫印迹法分析及免疫沉淀实验.
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尿路致病性大肠杆菌fimC和fimH基因诱导小鼠免疫应答的初步研究
尿路致病性大肠杆菌(UPEC)是引起尿路感染的主要病原菌.此类大肠杆菌80%携带Ⅰ型菌毛.现已证明UPEC的Ⅰ型菌毛的编码基因位于染色体上,由9个基因组成.其中fimH基因编码的蛋白--FimH粘附素,能与泌尿道上皮细胞表面甘露糖受体结合并可诱导细菌的细胞内在化.FimC蛋白是FimH蛋白的伴侣分子,在保持Ⅰ型菌毛的折叠和长度上起着关键的作用,可增强FimH蛋白的免疫原性[1].Langermann等制备FimH和FimC纯化蛋白混合疫苗,可以诱发动物产生抗Ⅰ型菌毛抗体,使猴对UPEC的感染有保护作用[2,3].
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抗肝癌人源化Diabody在大肠杆菌中的可溶性表达及活性鉴定
目的:构建人源化抗肝癌双价抗体,并实现其在大肠杆菌中的可洛性表达.方法:缩短人源化抗肝癌单链抗体hscFv25的连接肽为5肽,构建(hscFv25)2基因,克隆入原核表达载体后,转化入大肠杆菌表达,并纯化目的蛋白,细胞ELISA、免疫组织化学法检测其生物活性.结果:目的基因在大肠杆菌中得到了可洛性表达,纯化蛋白的相对亲和力比亲本抗体提高了10倍左右,对肝癌组织切片的免疫组织化学染色呈强阳性,阳性率为75%.结论:成功制备了人源化抗肝癌双价抗体,该抗体具有较高的亲和力,为进一步的临床研究奠定了基础.
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副溶血弧菌不耐热溶血毒素的表达与纯化
目的表达和纯化融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素.方法将表达载体pET32a+-tlh转化大肠杆菌BL21(λDE3),诱导表达副溶血弧菌不耐热溶血毒素,表达产物用聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定,8 mmol/L的尿素溶解包涵体,用6×his组氨酸蛋白质镍亲和层析树脂亲和层析纯化目的蛋白.结果诱导表达的目的蛋白以包涵体形式存在,其含量约占菌体总蛋白的10%,纯化获得了高纯度的融合表达的副溶血弧菌不耐热溶血毒素.结论转化有重组质粒pET32a+-tlh的BL21(λDE3)可稳定高效地表达目的蛋白,采用低浓度的咪唑、β-巯基乙醇和Tritonx-100等方法减少杂蛋白污染,亲和层析纯化目的蛋白,可获得高纯度的目的蛋白.
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长期表现为肺间质病变的多发性肌炎1例
患者女,63岁.因"间断干咳、发热,伴胸闷、气短4年余,四肢肌无力2个月"于2004-07-14住院.患者于2000年初无诱因出现干咳,咯少量白色痰,体温38~39℃,多次血常规、胸部X线片、结核抗体、结核纯化蛋白试验检查正常,血沉43~120 mm/h,痰多次查癌细胞和抗酸杆菌阴性,查到炎性细胞.
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沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白Vp1血清抗体的检测
衣原体噬菌体作为一种侵袭衣原体的病毒可使衣原体解体,具有抗感染的作用.目前已经发现6种衣原体噬菌体,其上的Vp1蛋白为衣原体噬菌体的衣壳蛋白.是主要的结构蛋白.该蛋白高度保守并可诱导机体产生抗体反应,适用于作为噬菌体的诊断抗原[1].沙眼衣原体是引起非淋球菌性尿道炎的主要病原体,其诊断困难、并发症严重.目前尚未在沙眼衣原体中发现噬菌体的存在.我们以豚鼠结膜炎衣原体(GPIC)噬菌体(PhiCPGI)的莺组Vp1纯化蛋白为抗原,通过ELISA法初步了解Ct感染者血清中针对Vp1蛋白的抗体,并用Western印迹法验证该抗体的特异性,推测Ct感染者血清中Vp1蛋白的存在,为沙眼衣原体与噬菌体的研究提供参考.
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SARS冠状病毒N蛋白的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化SARS冠状病毒的N蛋白,分析其诱导的免疫应答.方法从重组克隆pMD18-N中切取N基因的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达N蛋白,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.N基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌表达了SARS冠状病毒的N蛋白;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被重组N蛋白的GST融合蛋白的免疫血清识别,并诱导小鼠产生了高滴度的抗体和Th1/Th2型的免疫应答.成功构建了N蛋白的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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重组弓形虫GRA8的表达及其诱导的免疫应答
表达和纯化弓形虫RH株GRA8的截短型片段,分析其诱导的免疫应答.从重组克隆pMD18-GRA8中切取GRA8的插入片段,亚克隆至原核表达质粒pET-23a(+)中,转化大肠杆菌BL21,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE分析重组蛋白的表达;大量诱导表达GRA8,金属螯合层析予以纯化,将纯化蛋白免疫小鼠,观察其诱导的免疫应答.GRA8基因的特异片段被亚克隆到原核表达质粒pET-23a(+),在大肠杆菌中未见GRA8的明显表达;表达的蛋白经金属螯合层析获得纯化;纯化蛋白能被弓形虫感染兔血清识别.成功构建了GRA8的原核重组表达质粒,纯化的蛋白具有良好的抗原性.
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不同纯化方法提纯囊虫抗原效果对比
目的:寻找适合实验室和大量纯化囊虫抗原的佳载体和方法.方法:应用(1)AlfGa10作为载体,常规洗涤、装柱、包被、过柱、洗涤、脱洗、透洗.(2)33%过硫酸氨纯化、透洗.(3)特异抗体致敏医用磁粉球,置含有0.85%Nacl容器内,37℃lh、洗涤、脱洗、透洗.取三种不同方式纯化的抗原,测其含量;电泳分析其纯度;检测已知囊虫和其他寄生虫病患者,了解其特异性和敏感性.结果:用AlfGa10载体纯化囊虫抗原,单次纯化量为117mg,后两种方法无限量;用AlfGa10和医用磁粉球纯化的囊虫抗原,电泳结果显示出两条清晰的蛋白带,而过硫酸氨纯化的囊虫抗原电泳结果显示出多条不清晰的蛋白带,三种不同抗原ELISA方法检测囊虫患者血清,检出低抗原量均在0.1-0.2ug/ml,用AlfGa10和医用磁粉球纯化的囊虫抗原检测囊虫和其他寄生虫患者血清,无假阳性结果,而用过硫酸氨纯化的囊虫抗原的检测结果,假阳性率较高,包虫患者假阳性率达83%.结论:应用医用磁粉球纯化蛋白,方法简便,纯度高,易于批量纯化,是一种理想的载体.
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人致病性呼肠孤病毒M3编码蛋白纯化及多克隆抗体制备
目的:根据构建的人致病性纳尔逊海湾病毒(NBVs)M3基因片段质粒,纯化融合蛋白制备NBVs M3多克隆抗体。方法利用构建的纳尔逊海湾病毒(NBVs)M3基因质粒Pris His MB- M3,转化至大肠埃希菌(E. coil)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β- D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达,产物经过镍柱亲和层析法获得Pris His MB- M3融合蛋白;将纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔,获得NBVs M3多克隆抗体;蛋白免疫印迹检测(Western blot)蛋白准确性以及多克隆抗体抗性。结果 SDS- PAGE电泳考马斯亮蓝染色检测显示:25℃、IPTG 浓度为0.3 mmol/L,诱导12 h,Pris His MB- M3融合蛋白表达量高;在咪唑浓度为MCAC-20、MCAC-40条件时洗脱下目的蛋白。用纯化的融合蛋白免疫家兔制备抗体,Western blot验证成功制备出NBVs M3多克隆抗体。结论成功获得了灵敏性及特异性较高的纳尔逊海湾病毒(NBVs)M3多克隆抗体,为进一步研究该病毒的致病性提供了很高的应用价值。
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登革病毒2型非结构蛋白NS2B的原核表达、纯化及其抗体的制备
目的 原核表达登革病毒(Dengue Virus,DV)NS2B蛋白并纯化,制备NS2B的小鼠多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增DV2全长的NS2B基因序列,构建表达带有6×His标签的NS2B的原核表达载体,进行表达与纯化,免疫Balb/c小鼠,制备NS2B多克隆抗体.采用ELISA检测抗体效价,Westem-blot及免疫荧光染色检测其特异性.结果 成功构建原核表达载体pQE-31/NS2B,进一步获得相对分子质量为16 000的纯化蛋白及多克隆抗体,EHSA显示抗体效价达1:25 600.Western-blot和免疫荧光染色显示多克隆抗体与NS2B蛋白特异性结合.结论 本研究获得了纯化的DV2 NS2B蛋白,成功地制备了NS2B多克隆抗体,为进一步研究NS2B的作用机制奠定了基础.
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猪XCL1蛋白纯化、多克隆抗体的制备及其生物活性鉴定
目的:纯化获得体外表达猪his-XCL1的重组蛋白,制备多克隆抗体并研究其对淋巴细胞增殖的影响.方法:首先,采用HiTrapTM Chelating HP纯化方法,SDS-PAGE检测重组蛋白纯化情况,Western blot检测重组蛋白表达情况.再免疫动物制备多抗血清,双向琼脂扩散试验、间接ELISA检测多克隆抗体效价,MTT法检测猪XCL1对淋巴细胞增殖的影响.结果:当结合缓冲液的浓度为40 mmol/L,洗脱缓冲液500 mmol/L时,SDS-PAGE电泳可观察到有单一目的条带,Western blot显示重组蛋白成功表达,双向琼脂扩散试验证实抗原抗体的结合比为1∶8,间接ELISA检测到抗体水平达到1∶12 800.重组蛋白XCL1能促进淋巴细胞的增殖,而此实验制备的多克隆抗体可以阻断这种效应.结论:体外表达的重组蛋白具有生物活性,制备的多克隆抗体为研究XCL1在猪体中的功能提供科技资料.
关键词: XCL1 纯化蛋白 多克隆抗体 间接ELISA:MTT