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重组人α-2b干扰素发酵及粗提条件的优化研究
目的:探讨从基因工程菌Escherichia coli发酵表达和提取α-2b干扰素的优化方法.方法:采用高密度发酵表达α-2b干扰素,并对发酵培养条件进行优化.用8M尿素提取包涵体,在复性液中加入适量的还原剂,探索提取干扰素的佳条件.结果:湿菌体平均产量22g/L,生物活性7.92×108IU/L.复性后α-2b干扰素纯度达到80%,收率为62%.结论:发酵、提取效果令人满意,收率较高.
关键词： 重组人α-2b干扰素 高密度发酵 包涵体 精氨酸 -
转基因作物标记蛋白HPT融合表达载体构建、纯化及复性研究
目的 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)是转基因作物中广泛应用的抗生素标记基因,本研究构建该基因的融合表达载体,以期得到足量纯化的HPT蛋白,为该外源蛋白的进一步安全性评价奠定基础.方法 将hpt基因克隆到线性表达载体pET41 EK/LIC中,得到该基因的融合表达载体pET41EK/HPT,将pET41EK/HPT载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,沉淀中的包涵体进行了稀释复性、柱上复性和N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解稀释复性等复性研究及活性测定、标签切除、N端测序等工作.结果 融合蛋白主要以无活性的包涵体形式存在,各复性方法表明SKL溶解稀释复性得到的蛋白在活性及产率方面明显高于其他两种方法,利用该方法每升培养物可获得78mg活性HPT融合蛋白,纯度约为93%,经肠激酶切割后,得到的蛋白与天然HPT蛋白N端氨基酸序列完全相同.结论 利用本研究方法可得到在活性、分子量及氨基酸序列等方面与天然HPT蛋白一致的目的蛋白.
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复方天然和复方人工熊胆滴眼液治疗急性细菌性结膜炎对照观察
2006年2-6月我们用复方天然和复方人工熊胆滴眼液治疗急性细菌性结膜炎,并比较两种药物的疗效及安全性,现将结果 报告如下.临床资料1病例选择纳入标准:(1)符合急性结膜炎诊断标准[1];(2)病程＜3天,未经过其它抗菌药治疗者.排除标准:(1)麻疹、水痘、风疹引起的急性病毒性结膜炎、咽-结膜炎、包涵体性结膜炎、过敏性结膜炎者;(2)眼中过敏体质者.
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发热伴血小板减少综合征病毒感染人源巨噬细胞形成包涵体结构
发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)是在我国首次发现的布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新型病毒,是新发传染病发热伴血小板减少综合征的致病病原.本研究通过免疫荧光共聚焦实验观察不同感染剂量和不同感染时相SFTSV核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein,NP)在THP-1细胞内的动态定位特点,并应用电镜方法在超微结构水平观察不同感染时相THP-1细胞的胞内形态结构特征,发现SFTSV感染THP-1在胞内形成包涵体结构.研究进一步显示感染后的第3天核衣壳蛋白NP所形成包涵体的形态大小与感染后第7天培养上清中的病毒载量之间存在相关.本研究揭示SFTSV感染人源巨噬细胞THP-1形成的包涵体结构可能是SFTSV利用宿主细胞形成的特殊胞内结构以利于大量合成和产生新的病毒颗粒.
关键词： 发热伴血小板减少综合征病毒 巨噬细胞 包涵体 核衣壳蛋白 -
人干扰素ω(huIFN-ω)的高效表达、纯化及生物学活性
为了获得人干扰素-ω(huIFN-ω)在大肠杆菌中的高效表达,根据大肠杆菌的偏爱密码子,人工设计并合成了huIFN-ω高表达基因,并克隆到原核表达载体pBV220,在大肠杆菌DH5α中实现了高效表达,目的蛋白占细胞总蛋白的15%左右,以包涵体形式存在.表达产物经变性、复性及阳离子和分子筛层析纯化,纯度达90%以上,产物的抗病毒活性约为1.0×108IU/mg,并具有体外促NK杀伤活性.此结果为进一步研究和开发重组huIFN-ω奠定了基础.
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卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF融合蛋白的构建、表达及活性测定
目的构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv和鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM),以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应,为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据. 方法用DNA重组技术,将mGM-CSF连于单链抗体6B11ScFv羧基末端,构建重组质粒pET30-6B11mGM,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,以包涵体形式获高效表达,超声破碎细菌细胞获得包涵体,用8mol.L-1尿素溶解包涵体后直接稀释复性,SDS-PAGE分析蛋白纯度,ELISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性. 结果复性蛋白纯度达90%以上.采用氧化型谷胱甘肽(GSSG)浓度为1mmol.L-1,还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为5mmol.L-1,10℃复性48h,复性率达36%.表达的融合蛋白分别能与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合,并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖. 结论以包涵体表达的融合蛋白6B11mGM保留了两种蛋白的活性,为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础.
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蟑螂变应原Cr-PI包涵体的变复性研究
本研究优化了GST-Cr PI融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达条件和GST-Cr PI包涵体的复性条件;采用Glutathione SepharoseTM 4B亲和层析分离纯化融合蛋白,以Xa酶切去掉其GST标签后,对Cr PI进行了电喷雾电离串联质谱分析(ESI-MS/MS).结果表明,IPTG浓度对该蛋白的诱导效果影响不大,OD600值为0.6时诱导效果佳;复性蛋白浓度和L-精氨酸浓度对稀释复性结果有重要影响.纯化融合蛋白经Xa酶切、分子筛层析去掉GST标签后,重组蛋白的纯度达95%,经质谱进一步鉴定为蟑螂Cr PJ变应原.
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大肠杆菌胞内的共表达策略
大肠杆菌表达系统因其具有系统工具成熟、表达水平高、易于操作和成本低廉等优点而成为表达外源蛋白常用的表达系统之一.但该系统在表达外源蛋白,尤其是真核蛋白时也存在不少缺陷,其中主要的是由于大肠杆菌胞内缺乏帮助蛋白正确折叠的机制,所以相当一部分在大肠杆菌中表达的外源蛋白都聚集成沉淀,即以包涵体的形式存在,从而丧失了生物活性.
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控制麻疹的经济学评价
麻疹是一种严重危害儿童健康的急性呼吸道传染病,患者出现全身性皮疹达3天及以上,并有发热、咳嗽、流涕、眼结膜充血、颊粘膜斑,以及皮肤出现红色斑丘疹等症状[1].同时麻疹有严重的并发症,包括巨细胞肺炎、包涵体肺炎和少见的亚急性硬化性全脑炎(SSPE),由于麻疹感染可导致免疫抑制,继发性感染很普遍[2]
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蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2重组蛋白复性方法比较
目的 采用3种不同复性方法获得具有生物活性的重组蛋白蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(GlSir2),并比较3种方法的复性效率,为研究其活性和生物学功能奠定基础.方法 表达并纯化GlSir2的包涵体,分别采用稀释复性、透析复性和柱上复性等3种方法对GlSir2包涵体进行复性,并通过检测复性蛋白的活性,比较3种复性方法的特点.结果 蛋白活性回收以柱上复性较高,为1 712 Flu,透析复性和稀释复性法分别为758 Flu和206 Flu.结论 3种复性方法均能获得有活性的融合蛋白GlSir2,其中以柱上复性方法处理的蛋白活性回收值高.
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卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究
目的 探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体,小鼠热休克蛋白70(6B11ScFv/mHSP70)融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其佳体外复性条件.方法 大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv/mHSP70:①比较不同的裂解液(8 mol/L 尿素和6 mol/L 盐酸胍)对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度 L-精氨酸对蛋白稀释复件的影响;③比较稀释复性和柱上复性对融合蛋白复件效率及活性的影响.采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度.所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法.结果 以包涵体形式表达6B11ScFv/mHSP70蛋白:①经6 mol/L 盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8 mol/L 尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6 mol/L 盐酸胍彻底裂解的包涵体经8 mol/L 尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0.5 mol/L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)浓度比为1:5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低.结论 本研究建立了6B11ScFv/mHSP70融合蛋白的佳复性条件:包涵体经6 mol/L 盐酸胍彻底裂解后,再经8 mol/L 尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH:GSSH=1:5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.
关键词： 卵巢肿瘤 重组融合蛋白质类 HSP70热休克蛋白质类 抗体 包涵体 -
TRAIL和EGFR配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白制备过程的优化
目的对以包涵体形式表达的 TRAIL 和 EGFR 配体寡肽与力达霉素辅基蛋白融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 的制备过程进行优化。
方法对大肠杆菌原核表达 Ec-LDP-TRAIL 目的蛋白的温度、诱导物浓度、起始菌体密度及时间等条件进行优化；在Ni2+亲和层析纯化蛋白过程中对样品预处理以及纯化缓冲液成分进行优化；对纯化后蛋白的分步透析复性过程进行一系列优化，并通过基于 ELISA 的结合活性实验分析Ec-LDP-TRAIL 与肿瘤细胞的结合能力。
结果经过工艺优化后，纯化后的融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL纯度达95%以上，复性后 LB 培养基活性蛋白收率约为2.2 mg/L，与初始复性条件相比提高近2倍。复性后融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 显示出能够与人表皮癌 A431和人大细胞肺癌 H460细胞的结合活性。
结论融合蛋白 Ec-LDP-TRAIL 制备过程的优化为后续研发和生产奠定了实验基础，同时也为其他以包涵体形式表达的基于 TRAIL 的抗肿瘤蛋白药物的制备提供借鉴。关键词： 包涵体 重组融合蛋白质类 蛋白质复性 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 -
包涵体变复性技术研究进展
现代生物技术的迅猛发展使大规模表达异源重组蛋白成为现实,这极大地促进了蛋白类产品的开发,尤其是重组蛋白药物的研发.目前非糖基化的重组蛋白表达多采用大肠杆菌的原核表达系统,该系统的突出特点是表达产物多以包涵体形式存在.与蛋白可溶性表达相比,包涵体具有产量高、蛋白稳定、容易纯化等优点,对毒性蛋白制备尤其适宜.因此,采用包涵体形式已成为规模制备重组蛋白产品的主要途径之一.
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包涵体性纤维瘤病一例
患儿女,1.5岁.因足趾肿物逐渐增大2个月于2005年7月入院.患儿出生5个月时,左足第二趾背侧出现一高起皮面的肿物,逐渐增大,但无任何不适.体检:左足背侧见高起皮面的半圆型暗红色结节,与皮肤关系密切,不活动,表面皮肤温度无异常,局部无压痛,结节质地中等硬度,趾关节无畸形.X线:左足近第二趾骨处见0.5 cm大椭圆形高密度影重叠,病变与骨组织无联系,骨组织无破坏.手术见肿物位于皮下,与皮肤关系密切,与关节不通,完整切除.
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肺原发性脑膜瘤一例
患者男,50岁.因无明显诱因咯痰带血10 d,于2001年1月11日到我院就诊.患者有20余年吸烟历史,20支/日,嗜好饮酒,平素身体健康,发病后无消瘦乏力.入院时全身皮肤粘膜无黄染,浅表淋巴结不肿大.胸廓无畸形,双侧肺扩张度均等,语颤无增强或减弱,呼吸音清、未闻及音.X线检查见右肺下野与心右缘重合处有一片状致密阴影,双侧肋膈角清晰.CT检查见右肺下叶后基底段有软组织块影,密度略有不同,周边见短毛刺,增强后有强化;纵隔未见肿大淋巴结.B超检查腹腔脏器无异常.中枢神经系统检查未见异常.临床诊断"右肺周围型癌",行肺叶切除.手术见肺表面无皱缩,无黏连,肺内肿块呈球形,可活动,隆突下、支气管旁淋巴结略大. 病理检查:切除的右肺下叶,后基底段距支气管切线1.5 cm处见一球形肿块,7.0 cm×7.0 cm×6.5 cm大小,质硬,切之无砂砾感.切面灰白色,间有散在的灰黄色不规则质软区,稍粗糙,边界清楚,有包膜.周围肺组织未见明显异常.送检隆突下及支气管旁淋巴结各2枚,大者1.2 cm×1.0 cm×0.8 cm.镜下观察:肿瘤有较厚的纤维性包膜,与周围肺组织分界清楚.肿瘤由梭形细胞及上皮样细胞构成.梭形细胞较纤细,核细长或稍肥胖,呈束状、编席状排列,并形成旋涡状、车辐状结构;上皮样细胞胞质丰富, 排列紧密,界限不清,似合体状,细胞核卵圆形或圆形,核膜清楚,染色质较细,核仁细小,可见核内胞质性假包涵体或核内窗(图1),个图1 肿瘤细胞核内可见胞质性假包涵体 HE×400 别细胞有畸形核,未见核分裂象.上皮样细胞呈大小不一的片巢状分布,部分位于梭形细胞旋涡中央,
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Gallyas-Braak银染色方法在神经组织病变中的应用
Gallyas银染色为多种银染色法的一种.1971年由Gallyas[1]首先报道,后经Braak等[2]和Gallyas本人等[3]修订,主要用于阿尔茨海默病的病理组织学研究.近年来国外应用该染色方法发现不仅能显示神经原纤维缠结,而且对各种胶质细胞变性包涵体有良好的显示作用,故对多系统萎缩,进行性核上性麻痹,皮质基底节变性等变性疾病有重要的诊断价值.近来,我们开展了此方法,应用于神经系统变性病的诊断和研究工作中,并取得良好结果.现介绍给同道参考.
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重组人干扰素Epsilon的表达纯化及生物学性质研究
目的表达纯化一种新型重组人干扰素Epsilon(rhIFN-ε155ser),并对它的生物学特性进行初步研究.方法人工合成rhIFN-ε155ser的全基因序列,并按照大肠埃希菌密码子嗜性作适当改造,然后构建到原核表达载体pBV220,在大肠埃希菌DH5α中表达.将表达的包涵体蛋白纯化复性后,对终产物的抗病毒活性、细胞生长抑制活性和NK细胞刺激活性进行鉴定.同时,利用芯片技术,从基因的水平对rhIFN-ε155ser的生物机制进行初步的了解.结果rhIFN-ε155ser以包涵体的形式表达,经纯化蛋白纯度可达95%.复性后rhIFN-ε155ser在WISH抗VSV系统中的抗病毒活性可达6×105IU/mg.在100～1000 pg/ml下rhIFN-ε155ser具有剂量依赖性的抗增殖活性,而NK细胞刺激活性无剂量依赖性.基因芯片扫描发现,22 278个位点中,有283个基因显著上调,另外1894个显著下降.结论成功地表达了rhIFN-ε155ser,发现此IFN具有一定的抗病毒、抗增殖和NK细胞刺激活性.芯片技术可进一步拓展对IFN的功能研究.
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人巨细胞病毒包涵体--病毒核酸和特异阶段表达抗原的产物
目的探讨人巨细胞病毒包涵体的组成及意义.方法采用显微切割技术结合PCR和Southern杂交及免疫组织化学的催化信号扩增法,检测人巨细胞病毒的核酸和3种不同阶段表达的抗原.结果通过液压显微切割系统将组织中巨细胞病毒包涵体游离出来,PCR扩增出预期长度的DNA片段,Southern杂交证实为HCMV的核酸片段,催化信号扩增法检测结果显示包涵体主要表达立即早期和早期抗原DDG9/CCH2,而基质蛋白AAC10则为阴性.结论人巨细胞病毒包涵体的成分包含有病毒DNA和特异阶段表达的抗原产物.
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人血管抑素A K(1-3)基因的克隆表达、纯化及活性鉴定
目的 克隆人Angiostatin K(1-3)基因,获得有活性的重组人血管抑素蛋白,为进一步开发应用奠定基础.方法 以人新鲜肝脏组织为材料,通过RT-PCR得到人Angiustatin基因的AK(1-3)片段.构建重组质粒pET30a-Angiostatin,转化表达菌Rosetta(DE3),对转化子进行诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的 产物,并验证其活性.结果 获得了人Angiostatin基因AK(1-3)片段的正确序列,表达和纯化了人血管抑素蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%,纯化后证明表达产物具有较高纯度(达到90%).结论 Anginstatin K(1-3)可在原核融合蛋白表达载体中表达,且得到有活性的目的 蛋白.
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HPV16 L1重组蛋白的纯化及免疫原性的实验研究
人乳头瘤病毒(HPV)16、18型感染与宫颈癌的发生密切相关.本研究通过包涵体提取、溶解、变性、复性、纯化,获得GST-HPV16 L1融合蛋白,同时检测GST-HPV16 L1蛋白在体外复性过程中自我组装成病毒样颗粒(VLP)的情况.通过动物实验验证HPV16 L1融合蛋白的免疫学作用.
