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潮霉素磷酸转移酶文献资料
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转基因作物标记蛋白HPT融合表达载体构建、纯化及复性研究
目的 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)是转基因作物中广泛应用的抗生素标记基因,本研究构建该基因的融合表达载体,以期得到足量纯化的HPT蛋白,为该外源蛋白的进一步安全性评价奠定基础.方法 将hpt基因克隆到线性表达载体pET41 EK/LIC中,得到该基因的融合表达载体pET41EK/HPT,将pET41EK/HPT载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,沉淀中的包涵体进行了稀释复性、柱上复性和N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解稀释复性等复性研究及活性测定、标签切除、N端测序等工作.结果 融合蛋白主要以无活性的包涵体形式存在,各复性方法表明SKL溶解稀释复性得到的蛋白在活性及产率方面明显高于其他两种方法,利用该方法每升培养物可获得78mg活性HPT融合蛋白,纯度约为93%,经肠激酶切割后,得到的蛋白与天然HPT蛋白N端氨基酸序列完全相同.结论 利用本研究方法可得到在活性、分子量及氨基酸序列等方面与天然HPT蛋白一致的目的蛋白.
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转基因作物标记蛋白潮霉素磷酸转移酶活性的测定方法
潮霉素磷酸转移酶(HPT)是转基因作物中重要的标记蛋白,其活性的测定对含有该标记基因的转基因作物的植株构建、基因沉默、标记基因去除及安全性分析等具有重要的作用.本文综述了潮霉素磷酸转移酶活性测定的几种方法,包括放射化学法、抑菌生长法及酶耦联法,其中放射化学法用于检测组织粗提蛋白中的HPT活性,而其他两种方法适用于纯化过的HPT蛋白活性的检测.
