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转基因作物标记蛋白HPT融合表达载体构建、纯化及复性研究
目的 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)是转基因作物中广泛应用的抗生素标记基因,本研究构建该基因的融合表达载体,以期得到足量纯化的HPT蛋白,为该外源蛋白的进一步安全性评价奠定基础.方法 将hpt基因克隆到线性表达载体pET41 EK/LIC中,得到该基因的融合表达载体pET41EK/HPT,将pET41EK/HPT载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,沉淀中的包涵体进行了稀释复性、柱上复性和N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)溶解稀释复性等复性研究及活性测定、标签切除、N端测序等工作.结果 融合蛋白主要以无活性的包涵体形式存在,各复性方法表明SKL溶解稀释复性得到的蛋白在活性及产率方面明显高于其他两种方法,利用该方法每升培养物可获得78mg活性HPT融合蛋白,纯度约为93%,经肠激酶切割后,得到的蛋白与天然HPT蛋白N端氨基酸序列完全相同.结论 利用本研究方法可得到在活性、分子量及氨基酸序列等方面与天然HPT蛋白一致的目的蛋白.
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电热培养箱温控系统小改动实现了大用处
今年我校医学院病理教研室进行一项DNA基因科研工作,需要使用热恒温培养箱设备.但需两种温度(92℃的DNA变性温度,72℃的DNA复性温度)超出了一般培养箱温度控制系统的控温范围.
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报复性事实——GMP饮片认证企业生存状况调查
见到付永德秘书长,已是他从毫州回来的第7天.从他一脸焦虑的神情不难看出,调研结果比他出发前掌握的材料更加糟糕,接下来的谈话恰恰印证了记者的猜测.
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的克隆、表达、纯化和复性
目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.
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重组人leptin的复性、纯化和免疫学及生物学活性鉴定
对重组人leptin(rh-leptin)蛋白进行复性及纯化,并鉴定其免疫学及生物学活性.将由大肠杆菌(E.coli)重组表达获得的rh-leptin,复性、纯化后进行SDS-PAGE电泳和Western印迹杂交鉴定其特异性,并通过Km小鼠减肥实验及胃肠推进率测定实验检验其生物学活性.结果表明通过对rh-leptin进行复性和纯化,获得了高纯度的具有免疫学和生物学活性的rh-leptin蛋白,可供进一步研究应用.
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大肠杆菌表达的新一代重组人内皮抑素复性条件的优化
目的 优化新一代重组人内皮抑素(rhED)的复性方案并检测其抗血管生成活性.方法 用6 mol/L盐酸胍溶解rhED包涵体后,用稀释法与透析法相结合的方法进行复性,优化适复性条件.复性结束后用阳离子交换层析纯化.并用rhED特异性单抗和鸡胚绒毛尿囊膜实验检测复性后蛋门的活性.结果 通过优化复性条件,rhED的复性率可达到46%.复性、纯化后的rhED能与rhED特异性单抗反应,并在鸡胚绒毛尿囊膜实验中显示出抑制血管生长的活性.结论 提高rhED复性率的复性条件可极大地促进新一代rhED的临床前及临床研究.
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感光受体外周蛋白结合蛋白对虫荧光素酶体外折叠的促进作用
探讨感光受体外周蛋白结合蛋白(PBP)在体外是否有促进变性蛋白质复性的作用.虫荧光素酶用盐酸胍变性,然后在PBP、HSP70、HSP60存在下进行体外复性,用虫荧光素酶分析系统检测该酶的复性程度.结果显示PBP对虫荧光素酶的复性能力很低,当与HSP70同时作用时,酶活力明显高于PBP或HSP70组,而PBP与HSP60组合对酶的复性能力较HSP60组未见有明显差异;当PBP,HSP70,HSP60三者同时存在时,酶活力恢复率高.去除复性缓冲液中的ATP及其再生系统,酶活力的复性率明显下降.结果表明PBP具有协助HSP70,在ATP依赖的情况下促进变性虫荧光素酶体外复性的分子伴侣功能.
关键词： 感光受体外周蛋白结合蛋白 热休克蛋白 虫荧光素酶 复性 -
广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1的表达
将广西眼镜王蛇毒酸性磷脂酶A2-1(APLA2-1)基因克隆至表达载体pET28a(+),转化入大肠杆菌BL21,经过诱导,SDS-PAGE检测,重组质粒pET28a-APLA2-1在18KD有一明显的表达条带,表达产物APLA2-1约占细菌总量30%,并以包涵体的形式存在,将产物变复性后用Sephadex G-75 纯化,产物经过SDS-PAGE检测只有单一条带,通过Western-blot检测,证实纯化产物是酸性磷脂酶A2.对表达的APLA2进行酶活性和药理活性的测定.至此我们在大肠杆菌中表达了广西眼镜王蛇毒APLA2,这将为以后对PLA2的结构与功能的研究打下了良好的基础.
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蓝氏贾第鞭毛虫沉默信息调节因子2重组蛋白复性方法比较
目的 采用3种不同复性方法获得具有生物活性的重组蛋白蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia,Gl)沉默信息调节因子2(GlSir2),并比较3种方法的复性效率,为研究其活性和生物学功能奠定基础.方法 表达并纯化GlSir2的包涵体,分别采用稀释复性、透析复性和柱上复性等3种方法对GlSir2包涵体进行复性,并通过检测复性蛋白的活性,比较3种复性方法的特点.结果 蛋白活性回收以柱上复性较高,为1 712 Flu,透析复性和稀释复性法分别为758 Flu和206 Flu.结论 3种复性方法均能获得有活性的融合蛋白GlSir2,其中以柱上复性方法处理的蛋白活性回收值高.
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弓形虫昆山分离株P30蛋白的纯化、复性和鉴定
目的 表达并纯化弓形虫昆山分离株膜蛋白P30.方法 将构建的pET28b-P30重组质粒转入大肠埃希菌BL21,挑重组菌于LB培养基中增菌,IPTG诱导其表达,然后纯化包涵体,用尿素溶解包涵体,Ni2+ 螯合柱纯化产物,以透析法复性蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定.结果 大肠埃希菌表达的P30蛋白以包涵体的形式存在,P30蛋白经Ni2+ 螯合柱纯化后纯度大于95%.经Western blot鉴定,复性蛋白能被弓形虫感染的鼠血清识别.结论 得到了纯度高的膜蛋白P30.
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新一代重组人粒细胞集落刺激因子的工业化发酵、复性和纯化
工业化大规模发酵、复性和纯化突变型人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSFa),并测定其体外生物学活性.利用定点突变和DNA重组技术获得突变型G-CSF(rhG-CSFa).通过40 L发酵罐发酵基因工程菌株获得rhG-CSFa包涵体,经过一系列透析后,通过离子交换柱和分子排阻层析进行纯化,并使用高效液相色谱技术对纯化后的rhG-CSFa进行纯度分析.利用G-CSF依赖细胞株(M-NFS-60)测定纯化后的rhG-CSFa体外活性效价.结果表明,rhG-CSFa表达量占全菌蛋白的31.2％,通过优化复性条件,rhG-CSFa复性率达到11.36％,纯化后rhG-CSFa的纯度达到99.11％.体外活性实验显示,与野生型G-CSF相比,rhG-CSFa在相同浓度下能诱导NFS -60细胞株获得更高的细胞增殖率.rhG-CSFa工程菌株能够高表达rhG-CSFa,可用于工业化大规模生产,生产的rhG-CSFa具有较高的生物活性、稳定性和纯度.rhG-CSFa大规模生产的成功为该药物未来的临床运用打下了良好的基础.
关键词： 重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF) 发酵 复性 纯化 生物活性 -
HIV-1型整合酶蛋白的表达、纯化及复性研究
目的 对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究.方法 从HIV-1 HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因,连入原核表达载体pET-30a中,得到pET-30a整合酶表达质粒.再将质粒转人大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化后得到整合酶蛋白.纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定佳复性液,然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收,后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性.结果 HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总量的10%.经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0.9 mg/ml.蛋白的佳复性液是:Tris-Cl 55 mmol/L,NaCl 264 mmol/L,KCl 11 mmol/L,Gu-HCl 550 mmol/L,EDTA 1.1 mmol/L,以及附加成分中的GSH、GSSG.复性后蛋白抽干后再溶,溶液清亮透明,SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白.结论 成功构建了pET-30a整合酶表达质粒.纯化后蛋白的浓度较高.确定了佳的蛋白复性液.并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性.这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础.
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抗人肝癌基因工程嵌合Fab抗体的原核表达及复性
目的分别在大肠杆菌中高效表达嵌合Fd及嵌合轻链,并进行嵌合Fab复性的研究. 方法分别将嵌合Fd及嵌合轻链基因插入到原核表达载体pET32a中,构建成重组载体pET32a/cFd和pET32a/cL.转化大肠杆菌后诱导其表达.大量制备表达的嵌合Fd 及嵌合轻链后,按二者绝对量等摩尔比混合后进行透析复性.然后,分别利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA进行分析和鉴定. 结果成功获得了嵌合Fd及嵌合轻链的原核非融合高效表达,表达蛋白相对分子质量(Mr)均在24×103左右.表达量分别约占菌体总蛋白的28.3%和32.3%,2种目的蛋白均主要以不溶性的包涵体形式存在.另外,嵌合Fd与嵌合轻链在缓慢透析的条件下成功地复性为嵌合Fab抗体,Mr约为42×103,具有特异性抗原结合活性和良好的亲和力.在起始总蛋白浓度为100μg/ml时,复性效率约为49%. 结论成功实现了嵌合Fab抗体的高效表达及高效复性,为进一步探讨其在肝癌治疗中的应用奠定了基础.
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幽门螺杆菌vacA基因重组表达的包涵体复性及ELISA方法的建立
目的:通过对vacA重组工程菌表达产物包涵体的变性、复性,提高表达产物的生物学活性,建立ELISA方法,讨论VacA抗原规模生产的可行性.方法:利用已经构建的表达VacA抗原的工程菌,用IPTG诱导,表达的包涵体通过系列条件的变性、复性、透析,并经活性鉴定.所制抗原用以包被ELISA板,建立ELISA方法并确定抗原的生物学活性.结果:重组工程菌可表达Mr 3 300的目的蛋白,表达形式为包涵体,条件优化后的包涵体经SDS-PAGE显示纯度达95%以上,活性经ELISA法测定正常人126例和blot电泳测定结果符合率为97.1%.结论:包涵体变性复性后生物活性大幅度提高,并且具有良好的重复性和稳定性,可作为幽门螺杆菌疫苗制备的候选抗原及临床检测的诸多方法的抗原原料.
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夏天别凭感觉停药
对许多高血压患者来说,到了夏天,仿佛就进入了一个"安全期".他们惊喜地发现,自己的血压"不高了".于是,一些久病成医的老病号便自作主张,不去征求医生的意见,就擅自停药、减药或换药.寒冷使血管收缩,炎热使血管舒张,这是人体正常的生理现象.因此,气候变化对血压的影响的确存在,不少高血压患者血压随季节波动的现象,比正常人更为明显.但是,这一现象并不意味着冬天一定要增加降压药,夏天则可以减药或停药.影响血压的因素多种多样,气温只是其中一种,有的人在夏天容易心情烦躁、睡眠不好,同样会造成血压上升.还有一些患者对降压药非常敏感,一旦减药或停药,血压就会"报复性反弹",甚至比以前更高.
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心脏动作电位时限整复性--心室颤动电活动的决定因素
心室颤动(VF)是一种致死性心律失常,一般认为频发室性早搏(PVC)、室性心动过速(VT)是VF的先兆,因而预防心脏性猝死的思考和措施总是围绕着PVC和VT,特别是VT.
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腺苷在心血管病诊治中的应用前景
腺苷(adenosine)是一种嘌呤核苷,由糖苷键连接腺嘌呤和核糖而成.它是腺苷酸的前体,又是其代谢产物.许多细胞能"出产"腺苷,同时也有腺苷的受体.受体的激活通常可降低这些细胞或器官的总体作功和耗氧,因而腺苷是一种"报复性代谢产物"[1].
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腹腔镜胆囊切除术后戳孔疝一例
患者男,36岁.因剑突下易复性包块渐增大2年余,于2009年4月20日入院.患者于2007年3月于外院行腹腔镜胆囊切除术,术后2个月余剑突下戳孔处有一半球形包块突出,约3 cm×3 cm大小,无红肿及压痛,触之柔软,可回纳腹腔,平卧后包块可消失,可触及一类圆形腹壁缺损,可容纳约2指,拟诊断为剑突下腹壁戳孔疝.
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小鼠成纤维细胞激活蛋白α二肽基肽酶核心序列原核表达与纯化及复性
表达质粒,通过对转化该质粒后的感受态细菌进行菌液PCR鉴定以及对该质粒进行BamH I和Xho I双酶切鉴定,鉴定结果与预期结果完全一致;实现了对该质粒编码的融合蛋白His6-FAPαc的表达,表达后的融合蛋白主要以包涵体的形式存在,表达产量占菌体总蛋白＞70%;纯化了该融合蛋白,纯化后的蛋白纯度通过灰度分析＞99%;对该融合蛋白进行了复性,复性后该融合蛋白由不溶的包涵体状态变为可溶的水溶状态.结论:成功表达、纯化和复性了FAPα二肽酶催化核心区域FAPαc,为深入开展FAPα的研究奠定基础.
关键词： 成纤维细胞激活蛋白α 原核表达 纯化 复性 -
HER-2/neu配体结合区蛋白的表达、纯化及复性研究
目的:将HER-2/neu配体结合区(RLD)基因重组,并在大肠杆菌中表达,对以包涵体形式表达的融合蛋白进行变性和复性的研究.方法:采用PCR技术将HER-2/neu RLD的两段基因分别扩增,并利用基因片段末端的共同酶切位点将两段基因相连接,连接产物插入原核表达载体,在大肠杆菌中实现融合蛋白的表达.表达产物经SDS-PAGE和Western印迹检测后,进行蛋白质的变性、纯化和复性等处理.结果与结论:在大肠杆菌中实现了融合蛋白的高效表达,表达产物可被特异性抗体识别.经SDS-PAGE分析,表达产物以包涵体形式存在,通过变性、纯化和复性等处理,获得了含两个RLD的融合蛋白,从而为HER-2/neu肿瘤疫苗的研究打下了基础.
