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结核分枝杆菌MPT64蛋白的表达、纯化及初步应用
目的获得重组MPT64蛋白，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法应用基因工程技术表达、纯化MPT64蛋白，通过Western blotting分析其抗原性。分别以结核分枝杆菌PPD或纯化的rMPT64蛋白为抗原，通过ELISA方法及结核病一步法检测血清中抗结核抗体。结果重组质粒pET 15b-MPT64测序表达除83位密码子由CCA突变为CCG外，其余密码子均与报道的相同，但其氨基酸序列无变化。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的20～30%，分子量约26kDa，Western blotting分析它与抗结核分枝杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化后的rMPT64样品经SDS-PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为80%左右，每100ml培养菌可获得10mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值+2S为正常界限值，PDD的特异性和敏感性分别为94%(31/33)、63.7%(21/33)、66.7%；rMPT64纯化蛋白分别为 94%(31/33)、30.3(10/33)；一步法分别为88%(29/33)、66.7%(22/23)。结论 pET15b-MPT64大肠杆菌工程菌能以包涵体形式高效表达重组MPT64蛋白，该蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性。rMPT64纯化蛋白有可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。
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结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的克隆、表达、纯化和复性
目的 构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT 64的重组质粒,并在大肠杆菌中表达及纯化和复性重组蛋白.方法 用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出mpt64基因片段,插入PKRX-T载体中,再亚克降到表达载体PET30a中,在大肠杆菌中表达;应用组氨酸标签(His-Tag)纯化重组蛋白;在PBS中通过半透膜恢复重组蛋白的天然结构.结果 构建了含MPT64重组质粒的大肠杆菌工程菌,并以包涵体形式表达重组蛋白MPT 64,其占细胞总蛋白的20%～30%;重组蛋白变性后经镍柱纯化,其纯度达90%以上;通过半透膜完全恢复重组蛋白的天然结构.结论 具有天然结构和高纯度的重组融合蛋白有可能成为有效的结核病血清学诊断的候选抗原.
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SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究
目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的佳退火温度为65℃;文库优化时,佳Mg2+的浓度为1.5 mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg2+的浓度为0.75 mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍.将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572～1.606之间.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子.
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结核分枝杆菌MPT64蛋白适配子的筛选与鉴定
目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找早期诊断结核病的方法.方法 体外合成随机单链DNA(ssDNA)文库,以MPT64蛋白为靶物质,采取SELEX技术进行12轮筛选,将适配子库克隆、测序后,用DNAMAN软件对其结构进行分析,经生物素-链亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定亲和力,并利用捕获适配子与检测适配子组成的"三明治"夹心法对获得的适配子进行初步验证.将13个非结核分枝杆菌菌株和BCG菌株作为阴性组计为0,将结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌组作为阳性组计为1,采用MedCalc软件分析受试者操作特征曲线,确定佳阳性判定值,并构建散点图.结果 经12轮筛选后,随机挑选15个适配子与MPT64蛋白的亲和性进行分析,吸光度值为0.492～1.243,73.3％的适配子的吸光度值在1.0以上;二级结构分析显示,适配子与MPT64蛋白亲和性的基础主要是大口袋茎环结构,口袋与环之间的茎桥含有不同数量的GC碱基对;"三明治"夹心法对阴性组[非结核分枝杆菌标准菌株及卡介苗(BCG)株]和阳性组(结核分枝杆菌实验室H37Rv株及临床株、牛结核分枝杆菌标准株)共47个菌株培养上清的检测结果显示,在临界(cut-off)值为0.61时,H37Rv、牛结核分枝杆菌组为阳性,BCG株为阴性;阴性组标本的阴性检出率为85.7％,阳性组标本的阳性检出率为87.9％,表现出一定的检测价值.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白具有高亲和性的DNA适配子.
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免疫层析法检测MPT64蛋白在结核与非结核分枝杆菌鉴定中的临床应用价值
目的 评价免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌的临床应用价值.方法 采用免疫层析法检测201株分枝杆菌,其中包括4株结核分枝杆菌复合群(mycobacterium tuberculosis complex,MTC)标准株、135株结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株、17株非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacterium,NTM)标准株和45株NTM临床分离株的MPT64蛋白.结果 4株MTC标准菌株和135株MTB临床分离株中,138株MPT64蛋白检测阳性,1株检测为阴性,敏感性为99.3%(138/139),17株NTM标准株和45株NTM临床分离株MPT64蛋白检测均为阴性,特异性为100%(62/62),201株结核和非结核分枝杆菌MPT64蛋白检测的准确度为99.5%(200/201).结论 应用免疫层析法检测MPT64蛋白鉴别结核与非结核分枝杆菌敏感性高,特异性强,方法简便、快速、准确,具有良好的临床应用前景.
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牛型结核分枝杆菌MPT64蛋白的原核表达及纯化
目的 原核表达并纯化牛型结核分枝杆菌MPT64蛋白.方法 以牛型结核分枝杆菌Vallee株全基因组DNA为模板,PCR扩增MPT64基因,克隆至pET-28a(+)载体,构建重组原核表达质粒pET-MPT64,转化至E.coli BL21 (DE3)中,IPTG 诱导表达.表达产物经SDS-PAGE鉴定后,用Ni-NTA亲和层析纯化,Western blot鉴定纯化蛋白.结果 获得的MPT64基因测序结果与GenBank中登录的MPT64基因核苷酸序列同源性为100%;重组表达质粒pET-MPT64经酶切鉴定表明构建正确；表达的重组MPT64蛋白相对分子质量约为26 000,主要以可溶性形式表达,表达量约占全菌总蛋白的11%；纯化的重组MPT64蛋白纯度达93%,可与抗结核牛血清发生特异性反应.结论 成功原核表达并纯化了牛型结核分枝杆菌MPT64蛋白,其可作为诊断抗原用于新型牛结核病的检测.
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三种结核分枝杆菌分泌蛋白的抗体制备及其在抗原检测中的应用
目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESA-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白抗体,探讨其在检测结核抗原中的应用价值.方法 应用重组蛋白CFP10-ESA-6、MPT64和MPT63-MPT70免疫血清,制备包被抗体和标记抗体,建立检测3种蛋白的双抗体夹心法,并将其用于17种分枝杆菌培养上清液和341份临床血清标本的检测.结果 CFP10-ESAT-6的低检出浓度为25 ng/mL,MPT64和MPT63-MPT70均为50 ng/mL.CFP10-ESAT-6检测17种分枝杆菌培养上清液,只有结核分枝杆菌为阳性;而MPT64和MPT63-MPT70检测除结核分枝杆菌阳性外,还各有5种非结核分枝杆菌培养上清液为阳性结果.CFP10-ESAT6、MPT64和MPT63-MPT70检测165例临床诊断的肺结核患者血清标本阳性率分别为33.9%、41.2%和47.9%;检测112例非结核患者血清标本的假阳性率分别为1.8%、7.1%和10.7%;检测64例健康对照的假阳性率分别为0、3.1%和7.8%.结论 CFP10-ESAT-6、MPT64和MPT63-MPT70重组蛋白制备的抗体检测血清标本结核抗原的阳性率均不高,但特异性较好.
