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SELEX技术及其应用研究进展
SELEX技术是一类在体外筛选能与各种配体特异结合的寡聚核苷酸片段的一项新组合化学技术,具有靶分子范围广,筛选出的配体亲和力和特异性高等特点.筛选出的特异寡聚核苷酸片段,不仅在疾病的诊断、治疗与药物的快速开发等方面起着重要作用,也为核酸结构和功能的研究提供了一个有效的方法.
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针对于白蛋白的新型核酸适配体的筛选与鉴定
目的 研发能特异结合白蛋白的DNA核酸适配体,为去除实验样品中的白蛋白提供新型技术手段.方法 体外合成全长为59个碱基并含有21个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以白蛋白为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能特异结合白蛋白的核酸适配体;用流式细胞计量术来检测核酸适配体的富集程度、适配体与白蛋白的结合特性;用MFold软件预测其二级结构.结果 经过多轮筛选得到了能特异识别白蛋白的DNA核酸适配体A6,其Kd值为77.4 nmol/L,且基本不结合卵清蛋白、免疫球蛋白IgG等对照蛋白.结论 针对于白蛋白的DNA核酸适配体A6能选择性识别白蛋白,在去除实验样品中的白蛋白方面具有应用潜能.
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新型HER2适配体的筛选及鉴定
目的 研发能特异性结合人表皮生长因子受体2(HER2)的DNA适配体,为开发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术提供依据.方法 体外合成全长86个碱基并含有40个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以HER2表位肽为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能够选择性结合HER2多肽的核酸适配体；流式细胞术检测富集进度、适配体与HER2蛋白及HER2阳性细胞的结合特性；MFold软件预测二级结构.结果 经多轮筛选获得了能够识别HER2多肽的DNA适配体HA5,其能够选择性地结合HER2蛋白及HER2 阳性的乳腺癌细胞,而不结合胰蛋白酶和HER2阴性细胞.结论 DNA适配体HA5能选择性地识别HER2阳性的乳腺癌细胞,在研发针对HER2的新型肿瘤靶向诊疗技术方面具有应用潜能.
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针对干扰素-γ的新型核酸适配体的筛选及鉴定
目的 研发能特异性结合干扰素-γ(IFN-γ)的DNA适配体,为发展IFN-γ的新型检测技术提供基础.方法 体外合成全长为59个碱基并含有21个随机寡核苷酸的单链DNA文库,以IFN-γ蛋白为靶标,利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX),从单链DNA文库中筛选能够选择性结合IFN-γ蛋白的核酸适配体；流式细胞术检测富集进度、适配体与IFN-γ蛋白结合特性；MFold软件预测二级结构.结果 经多轮筛选获得了能够识别IFN-γ蛋白的DNA适配体B3-8,其能够选择性地结合IFN-γ蛋白,而与血清白蛋白的结合较弱.经检测其Kd值为185 nmol/L.结论 DNA适配体B3-8能选择性地识别IFN-γ蛋白,在研发针对IFN-γ的新型检测技术方面具有应用潜能.
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SELEX技术及其在医学中的应用
指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(Aptamer),且具有高亲和力.目前涉及多种疾病治疗的适配子,包括感染性疾病,肿瘤,心血管疾病,免疫系统疾病等已被筛选出来,并且疗效已经通过体外实验或动物模型得到证实.两个适配子已进入药物Ⅲ期临床实验阶段,还有很多适配子正处于预临床实验阶段,其中部分将很快进入临床实验.本文综述了SELEX技术及寡核苷酸适配子在治疗领域的新进展,并且对其前景进行了分析和预测.
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SELEX技术的应用及前景
SELEX技术是利用随机寡核苷酸尤其是RNA易形成多种空间结构的特性来进行筛选的组合化学技术,具有靶分子范围广,筛选出的配体亲和力和特异性高等特点.在药物的快速开发、临床诊疗及生命进化等基础研究中均有广阔的应用前景.
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全细菌SELEX技术筛选鸟分枝杆菌的适配子
目的 应用指数级富集配体系统进化技术(system evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选与鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)特异性结合的ssDNA适配子,建立酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oli-gonucleotide assay,ELONA)检测鸟分枝杆菌的方法.方法 设计并合成随机序列ssDNA文库,以鸟分枝杆菌为靶标,利用SELEX技术筛选特异性的ssDNA适配子,将亲和力高的适配子进行克隆、测序;用DNAMAN软件分析适配子的二级结构,并检测其特异性.结果 单适配子N1与鸟分枝杆菌结合的Kd为(246±21.87) nmol/L,即亲和力高,而对结核分枝杆菌等其他分枝杆菌亲和力较低.结论 应用SELEX筛选的鸟分枝杆菌ssDNA适配子N1具有较高亲和力和特异性,可作为鸟分枝杆菌检测及艾滋病合并鸟分枝杆菌感染的特异性诊断制剂.
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筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的研究
目的 建立SELEX技术筛选结核分枝杆菌CFP-10抗原适体的方法,并获得CFP-10 的高亲和性适体.方法 体外构建长度为78个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库,以微孔板为筛选介质,采用SELEX 技术筛选获得CFP-10的适体库.将适体库克隆、测序,用DNAMAN软件对其结构进行分析,利用酶联寡核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide sorbent assay,ELOSA)测定亲和力.结果 构建的ssDNA文库经过14轮筛选与CFP-10亲和力从0.273提高到1.265;克隆子测序,大多数长度与预期值相符.二级结构显示,口袋和茎环结构可能是适体与CFP-10结合的结构基础.结论 成功建立了SELEX筛选技术,并初步获得了CFP-10的高亲和性适体.
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MPT64抗体的适体在结核病血清学检测中的应用
目的 利用SELEX技术筛选MPT64抗体的适体建立混合夹心ELISA检测体系,应用于临床血清标本的检测,探讨该方法 潜在的实验室诊断价值.方法 利用竞争ELISA检测方法 ,测定不同浓度的MPT64抗原对后一轮ssDNA文库与靶物质亲和力的抑制率,选取优势序列且亲和性值较高的适体用于检测,优化混合夹心ELISA检测方法 ,确定MPT64抗体的检测下限和线性范围,同时检测230例临床血清标本.结果 在竞争ELISA结果 中,总反应体系为100μl,MPT64抗原浓度由2μg/ml增加到256 μg/ml时,对ssDNA文库的抑制率也由0.25%增加到80%.优化的混合夹心ELISA的检测体系:ssDNA包被浓度为0.1μg/孔、血清稀释度为1/200、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体浓度为1/40 000.MPT64抗体的检测下限为3 mg/L,线性范围为10～1000 mg/L.利用该体系检测100例结核病患者、100例健康体检者和30例非结核病患者血清,检测结果 用GraphpadPrism软件进行分析,结核病组与健康体检组、结核病组与非结核疾病对照组差异均具有统计学意义(P<0.001).统计学分析得到检测的特异性与敏感性分别为96.1%和31.0%.结论 利用适体建立的混合夹心ELISA用于结核病的血清学诊断具有一定的诊断价值.
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SELEX技术筛选结核分枝杆菌MPT64蛋白DNA适配子方法学研究
目的 利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术筛选能与结核分枝杆菌MPT64蛋白特异结合的寡核苷酸适配子.方法 体外合成长度为78个核苷酸的随机ssDNA文库,利用SEL-EX技术筛选,以MPT64蛋白为靶物质进行12轮筛选,利用生物素-亲和素显色系统检测寡核苷酸与蛋白的结合性.结果 SELEX技术筛选MPT64蛋白适配子的技术体系:PCR扩增的佳退火温度为65℃;文库优化时,佳Mg2+的浓度为1.5 mmol/L;不对称PCR法制备ssDNA时,Mg2+的浓度为0.75 mmol/L;以酶联板为介质筛选时,在10轮后筛选达到饱和,且随着筛选轮数的增加,PCR扩增产物的电泳条带逐渐单一、致密,亲和性检测显示第10轮获得的适配子库,比初始的文库亲和性吸光度(A)值增加了9.18倍.将适配子库克隆,随机挑取10个单克隆子,利用混合夹心法检测其与MPT64的亲和性,亲和性范围分布在0.572～1.606之间.结论 已初步筛选到与MPT64蛋白高亲和性结合的DNA适配子.
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丙型肝炎病毒核心蛋白寡核苷酸适配子的筛选与鉴定
目的筛选、鉴定抗HCV核心蛋白(C 蛋白)的寡核苷酸适配子(aptamers). 方法利用systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX)技术,以HCV C蛋白为靶分子,从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选与HCV C蛋白特异结合的寡核苷酸适配子,并进行了解离常数(Kd)测定和适配子序列测定.再分别利用Clustal W软件包和DNA Folding Sever分析适配子的一级结构和二级结构. 结果经过9轮循环筛选,随机ssDNA库与HCV C蛋白的结合率从0.5%上升到32.5%.所有的一级结构没有共同的同源序列,但可分5个家族,每个家族具有共同的保守序列.二级结构分析表明,适配子形成的茎环、凸环结构可能是与HCV C蛋白结合的结构基础.其中寡核苷酸适配子C4与HCV C蛋白特异结合的亲和力高,Kd值为68nmol/L. 结论利用随机寡核苷酸文库成功获得抗HCV C蛋白的寡核苷酸适配子.
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利用适配子抗病毒性肝炎的新型治疗策略
适配子(aptamer)指能与靶分子以高亲和力结合的配基,是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中通过反复"与靶分子作用-筛选-富集"过程而获得.
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SELEX技术在微生物检测中的应用
指数级富集配体的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),是20世纪90年代初建立的一项筛选技术,是一种研究核酸结构与功能的有效方法.它应用大容量的随机寡核苷酸文库,并结合体外PCR扩增技术,以指数富集能与靶分子特异结合的寡核苷酸,经过多轮筛选后,获得特异性强、亲和力高的寡核苷酸适配子(aptamers),具有库容量大、靶分子范围广、亲和力高、特异性强等优点,已成功应用于多种靶分子的筛选,除用于核苷酸序列、蛋白质、氨基酸外,还可用于染料、药物小分子(如茶碱)、生长因子、肽链、类固醇、糖类,甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等.其中蛋白类靶分子应用多,包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞黏附分子等.完整的病毒颗粒和细菌病原体也可通过SELEX技术筛选出高亲和力和特异性的寡核苷酸适配子.目前通过此技术筛选到的靶物质目的基因有近200种,SELEX技术为生物界、生物化学界、医学界提供了高效、快速的检测手段,特别是为小分子靶物质目的基因的结构及功能的研究开辟了广阔的前景.
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核酸适配体及其在生物医学研究中的应用
核酸适配体是经过指数富集配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到的能与金属离子、小分子、生物大分子,甚至整个细胞高专一性和亲和性结合的ssDNA或RNA分子.核酸适配体不仅具备抗体分子的识别特性,凡是涉及抗体的诊断领域,几乎都可以用核酸适配体来代替,而且还具备自己独特的优异性能,所以对核酸适配体的研究引起了许多科学家的关注.本文介绍了核酸适配体及其相关筛选技术(SELEX),综述了核酸适配体近年来在治疗新药、药物运输、癌细胞检测、生物成像、生物标志物的发现、毒品检测、抗病毒等生物医学领域中的应用,后对核酸适配体在生物医学上的应用前景进行了展望.
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靶标诱导变构解离SELEX技术筛选皮质醇特异核酸适体
目的 通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术获得皮质醇特异性核酸适体,建立高品质、超敏、易用和稳定的皮质醇检测试剂盒.方法 人工合成两端固定序列,中间为35 bp随机序列,生成80 bp长度ssDNA文库,捕获序列固定在磁珠上,文库与其退火组装,皮质醇的特异核酸适体通过我们建立的靶标诱导变构解离SELEX(TISSD-SELEX)技术获得.后一轮的PCR产物经克隆测序,MegAlign 和RNAstructure软件分析其一级和二级结构.实时(real-time)apta-PCR方法分析G12的亲和活性.结果 经过12轮筛选后,获得10个皮质醇的核酸适体.序列分析显示,特异核酸适体以高G含量核酸序列为主,软件预测其中8个序列主要以G四联体二级结构为主,候选核酸适体 G12显示了可以作为生物探针用于皮质醇检测.结论 成功建立TISSD-SELEX技术,获得小分子靶标皮质醇核酸适体.小分子靶标无需将其偶联在固相介质或大分子上,对靶分子结构、性质无特殊要求,因而有望成为小分子靶标核酸适体筛选的通用技术方法.
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SELEX法筛选炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的研究
目的:利用SELEX(system evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术,寻找能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的寡核苷酸适配子(aptamer).方法:体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA库,通过SELEX技术,以炭疽芽孢杆菌疫苗株A.16R的芽孢为靶标进行15轮的筛选,利用生物素-亲和素显色系统判断寡核苷酸与芽孢的结合活性.结果:随着筛选轮数的增加,PCR扩增电泳条带逐渐单纯,寡核苷酸与芽孢结合后显色,D值提高了9倍以上,D值随适配子结合量的增加而递增.结论:已初步筛选到与炭疽芽孢具有亲和力的适配子.
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泡沫细胞寡核苷酸适配子PM2的特异性研究
目的 研究寡核苷酸适配子对动脉粥样硬化病变组织结合的特异性.方法 将前期研究获得的特异性适配子命名为PM2,FITC标记后,荧光显微镜分别观察适配子与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞、巨噬细胞源性泡沫细胞结合情况.采用高脂方法建立兔的动脉粥样硬化模型.利用PCR方法和荧光显微镜观察适配子与动脉粥样硬化病变结合情况.结果 PM2适配子与巨噬细胞源性泡沫细胞高度特异性结合,但不与血管平滑肌细胞、巨噬细胞、内皮细胞结合;PM2适配子能特异性结合动脉粥样硬化斑块组织,而不结合正常动脉组织结合.结论 筛选出的PM2适配子特异性结合巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变.
关键词： SELEX 特异性 巨噬细胞源性泡沫细胞 动脉粥样硬化病变 -
核酸适配子在生物医学领域中的应用
1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer).由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注.本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述.
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SELEX技术筛选变形链球菌UA159适配子可行性的研究
目的:研究SELEX技术用于筛选口腔致龋菌适配子的可行性.方法:化学合成长度为35mer的随机ssDNA文库,利用SELEX技术,分别以变形链球菌UA159(以下简称变链UA159)、乳杆菌和离心管作为靶物质,筛选适配子,不对称PCR扩增筛选产物,所得适配子进行克隆、测序,分析其二级结构,并对其二级结构进行了初步分析.结果:显示各个靶物质的筛选产物在第二轮筛选时就已经表现出具有特征性的二级结构.结论:SELEX技术可以用于口腔致龋菌适配子的筛选.
关键词： SELEX 变形链球菌UA159 乳杆菌 适配子 二级结构 -
DNA适体筛选中双链DNA拆分方法研究
目的 研究能够用于DNA适体筛选的双链DNA拆分方法.方法 采用琼脂糖凝胶电泳,观察和比较λ核酸外切酶法、不对称PCR法、磁珠法以及琼脂糖凝胶法的拆分效果.结果 琼脂糖凝胶电泳显示,λ核酸外切酶法不能充分拆分双链DNA形成单链DNA；不对称PCR法产生的非特异性单链DNA较多；磁珠法拆分双链DNA获得单链DNA的量较低,且成本较高；琼脂糖凝胶法拆分双链DNA较为充分,单链DNA纯度较高.结论 琼脂糖凝胶法可用于DNA适体筛选中双链DNA的拆分.
