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基于核酸的疾病诊断技术新进展
随着现代生活品质的不断提升，疾病早期诊断的重要性日益凸显，因此越来越多研究工作致力于发展新的疾病诊断技术。“精准医学”的提出，为新技术的发展提出了更高的要求，也代表着人们更高的期盼。在“精准”的道路上，化学生物学，小分子作为探针，用于生命体系内重要生物靶标的检测与功能调控，已成为生物与医药领域发展的新的趋势与方向。与此同时，核酸作为遗传物质，其结构、功能、化学修饰等，皆与基因表达、蛋白质的合成、细胞信号转导等重要生命过程密切相关。因此，核酸相关的生物靶标具有重大研究价值，对于重大疾病的机制研究，创新药物的开发，疾病诊断等有重要意义。这里，我们将对适配子技术和一些核酸相关重要靶标，如核酸表观遗传修饰、循环miRNA等的化学法检测这几个方向的新进展，进行讨论和总结，为后续研究工作提供参考。
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胶体金色谱技术在赭曲霉毒素A快检中的研究进展
赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA)是一类主要由曲霉属和青霉属等真菌产生的次级代谢产物,广泛存在于各种食品及中药材中.其痕量、剧毒、受污染、基质复杂等特点,给实际检测造成了很大困难.在众多检测技术中,胶体金色谱技术以其灵敏度高、特异性好、经济实用、使用方便等优点在OTA快速检测中广泛应用.近年来,随着适配子技术的进步及其在色谱技术中的应用,发展了新型胶体金适配子色谱技术.该文阐述了2种胶体金色谱技术的构造及原理,重点介绍了新型胶体金适配子色谱技术,归纳并比较了它们在OTA快速检测中的应用,展望了胶体金色谱技术的发展趋势,以期为相关研究提供参考.
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SELEX技术及近年研究进展
指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)是近20年来出现的一种新型体外筛选技术.该技术将文库技术与筛选技术相结合,从核酸文库中筛选出的一段核酸分子:配基-适配子(aptamer);适配子与抗体类似,可以与相应靶物质特异性结合.SELEX技术筛选适配子的技术有快速的进步,而适配子也被应用到医学生物学等各个方面.在HIV等病毒学研究与治疗方面,SELEX的应用也有了可观的进展,多种病毒的相关适配子被筛选出来,为病毒相关疾病的防治提供了新的方向.本文主要就近三年来的SELEX技术发展状况及在应用上的发展进行简要综述.
关键词： 指数富集的配体系统进化 适配子 -
SELEX技术及其在医学中的应用
指数富集配基的系统进化(SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过筛选、分离、富集获得能与各种配体特异结合的寡核苷酸适配子(Aptamer),且具有高亲和力.目前涉及多种疾病治疗的适配子,包括感染性疾病,肿瘤,心血管疾病,免疫系统疾病等已被筛选出来,并且疗效已经通过体外实验或动物模型得到证实.两个适配子已进入药物Ⅲ期临床实验阶段,还有很多适配子正处于预临床实验阶段,其中部分将很快进入临床实验.本文综述了SELEX技术及寡核苷酸适配子在治疗领域的新进展,并且对其前景进行了分析和预测.
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全细菌SELEX技术筛选鸟分枝杆菌的适配子
目的 应用指数级富集配体系统进化技术(system evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选与鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)特异性结合的ssDNA适配子,建立酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oli-gonucleotide assay,ELONA)检测鸟分枝杆菌的方法.方法 设计并合成随机序列ssDNA文库,以鸟分枝杆菌为靶标,利用SELEX技术筛选特异性的ssDNA适配子,将亲和力高的适配子进行克隆、测序;用DNAMAN软件分析适配子的二级结构,并检测其特异性.结果 单适配子N1与鸟分枝杆菌结合的Kd为(246±21.87) nmol/L,即亲和力高,而对结核分枝杆菌等其他分枝杆菌亲和力较低.结论 应用SELEX筛选的鸟分枝杆菌ssDNA适配子N1具有较高亲和力和特异性,可作为鸟分枝杆菌检测及艾滋病合并鸟分枝杆菌感染的特异性诊断制剂.
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应用CS-SELEX技术筛选特异性结合丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B适配子的研究
目的 应用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特异性结合的ssDNA适配子,建立检测HCV NS4B的酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法.方法 构建pDisplay-NS4B质粒,并转染至HepG2细胞中,在G418存在情况下连续筛选1个月,得到单克隆细胞群,经过Western blot以及流式细胞术验证,获得稳定表达NS4B的HepG2细胞.设计并合成随机序列ssDNA文库,以稳定表达NS4B的细胞为正向筛选靶细胞,以HepG2细胞为反筛细胞进行CS-SELEX技术筛选.每轮筛选获得的具有结合NS4B能力的ssDNA适配子,通过PCR扩增得到富集,随后通过不对称PCR获得下一轮筛选的ssDNA文库.经过16轮筛选,将亲和力高的筛选产物克隆并测序,用ELONA方法检测适配子的亲和力.结果 成功构建表面展示表达重组质粒pDisplay-NS4B.分别将该质粒转入HepG2细胞,通过G418筛选获得稳定表达HCV-NS4B的细胞系NS4B-HepG2.对CS-SELEX筛选的各轮适配子库进行亲和力测定,其中第14轮库适配子与NS4B的亲合力高.分别对第14轮库中的单个适配子进行亲和力测定,以适配子ZN1和ZN5与NS4B的亲合力高.ZN1和ZN5不仅能结合展示在细胞表面的NS4B蛋白,还能结合丙型肝炎病毒感染细胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白.结论 适配子ZN1和ZN5对NS4B有高亲和力,这对研究HCV-NS4B致癌机制、HCV诊断以及治疗方面有潜在的应用价值.
关键词： 丙型肝炎病毒(HCV) 非结构蛋白-NS4B CS-SELEX 适配子 -
筛选HIV-1 P24蛋白适配子的一种简便的SELEX方法
目的 快速筛选HIV-1 P24抗原适配子,并验证其特异性与亲和力.方法 利用聚碳酯材料PCR板包被P24抗原,在PCR板中运用SELEX技术进行适配子筛选.对多条适配子序列进行了一级结构及二级结构软件分析.酶联免疫法(ELISA)对筛选到的适配子进行亲和力及特异性验证.结果 确定用聚碳酯材料可以包被P24抗原,ELISA法检测抗原包被浓度与吸光度(A值)正相关；电泳显示适配子得到富集筛选；测序后软件分析表明多条适配子有共有序列,空间结构多样；用ELISA法,结合辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)与生物素标记的适配子,对适配子与P24的亲和力进行验证,表明筛选到的适配子与P24抗原有特异性的高亲和力结合.结论 建立了一种简便的筛选HIV-1 P24抗原适配子的方法,筛选到特异性的高亲和力P24适配子.
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利用SELEX技术构建靶向光敏药物
肿瘤是目前威胁人类健康凶险的疾病之一.寻找选择性好、副作用小的防治恶性肿瘤的新方法仍然是当今医学研究的热点.光动力学疗法是近年来兴起的极具应用前景的肿瘤治疗新方法.开发新型靶向光敏剂和开展靶向光动力治疗是进一步发展光动力治疗肿瘤的重要方向.本文简述了目前光动力治疗及常用光敏剂的研究现状,并提出通过指数式富集法配体进化技术即SELEX技术构建靶向光敏药物的新设想.
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“适配子-PLGA纳米粒”靶向超声/光声相变造影剂的制备
目的 研制一种适配子偶联的包裹纳米金棒和液态氟碳的PLGA纳米粒.方法 采用双乳化法制备包裹纳米金棒及全氟己烷(PFH)的PLGA纳米粒(GNP);用碳二亚胺法将适配子与PLGA纳米粒连接获得“适配子-PLGA纳米粒”靶向相变造影剂(AP-GNP).光镜、激光共聚焦显微镜及电镜下观察及检测AP-GNP基本性质;激光共聚焦显微镜下及流式细胞术观察及检测适配子与纳米粒连接情况;以激光仪辐照AP-GNP观察其光致相变情况;观察AP-GNP与乳腺癌细胞MCF-7特异性结合情况.结果 成功制备适配子修饰的包裹纳米金棒和PFH的PLGA纳米粒,其平均粒径为(472.43±25.82)nm,适配子与纳米粒的连接率为达97.98％;激光辐照AP-GNP后,光致相变效果明显;AP-GNP粘附于MCF-7细胞周围,未修饰适配子GNP未见明显特异性结合.结论 成功制备偶联的包裹纳米金棒和PFH的PLGA纳米粒,其光致相变效果明显,靶向性能良好.
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CELL-SELEX技术及其在白血病研究中的应用
由于临床症状的复杂多变和不确切的发病机制,使白血病的诊断和治疗都面临巨大的挑战.CELL-SELEX技术不仅能获得与靶细胞相结合的高亲和力、高特异性的适配子,而且该适配子能够区分细胞所处的某种特定状态,如未分化与分化、正常细胞与癌细胞的区别等,使得该技术在白血病研究中具有极大潜能；本文阐述了CELL-SELEX技术的优越性及其在白血病特异性诊断、靶向治疗和肿瘤标志物发现方面的应用策略.(中华检验医学杂志,2013,36:377-379)
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丙型肝炎病毒相关适配分子的研究进展
指数富集配基的系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术是一类新的组合化学技术,应用人工合成的随机寡核苷酸文库,通过体外筛选、分离、富集获得能与靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子.具有实用范围广、筛选过程简便、适配子有高特异性和高亲和性等特点.适配子的选择性在很多方面优于抗体,在分子识别研究中具有重要价值,可用于靶物质的测定、阻断靶物质的生物活性.本文综述SELEX技术及寡核苷酸适配子在丙型肝炎病毒诊断和治疗领域的新进展,并且对其前景进行分析和预测.
关键词： 适配子 丙型肝炎病毒 指数富集配基的系统进化技术 -
CELL-SELEX方法筛选IL-17RA特异性DNA适配子的研究
目的 获得IL-17受体A(IL-17RA)特异性DNA适配子,抑制IL-17与其受体IL-17RA结合.方法 运用细胞数富集性配体系统进化方法(CELL-SELEX)获得IL-17RA特异性DNA适配子.首先将NIH3T3细胞与随机单链DNA文库孵育,收集与细胞结合的DNA.将这些DNA再与IL-17RA表达缺陷型NIH3T3细胞孵育,收集上清液中游离DNA作为下一轮筛选模板.经12轮筛选获得IL-17RA特异性适配子.EILISA和流式细胞仪筛选亲和力好的单适配子,并检测它与NIH3T3细胞及IL-17RA蛋白的结合能力.结果 获得与IL-17RA具有高亲和力的单适配子RA10-6,体外实验证实RA10-6可有效阻止IL-17结合IL-17RA,并呈剂量依赖性.结论 RA10-6可抑制IL-17与IL-17RA结合,可作为潜在的IL-17受体阻断剂治疗骨关节炎.
关键词： 适配子 白细胞介素17受体A 骨关节炎 -
白细胞介素17受体A特异性DNA适配子抑制小鼠实验性关节炎滑膜炎症
目的：检测白细胞介素（interleukin，IL）-17受体A（IL-17RA）特异性DNA适配子RA10-6对小鼠实验性关节炎的治疗作用。方法手术切除小鼠膝关节外侧半月板，建立外伤性实验性关节炎的小鼠模型。术后每周经关节腔注射适配子或其它药物对照，6周后观察膝关节病理标本，并检测滑膜组织IL-6，IL-8，IL-1β等细胞因子表达。结果 RA10-6能显著抑制关节炎小鼠滑膜增生，抑制小鼠滑膜组织IL-6的表达并呈剂量依赖性，与塞来昔布联用时抑制滑膜炎症的效果比单独使用更好。结论 RA10-6通过抑制IL-17与IL-17RA结合，抑制滑膜组织分泌IL-6，从而减轻关节炎小鼠的滑膜炎症。此外，RA10-6联合应用塞来昔布能达到更好的减轻滑膜炎症的效果，可作为一种辅助治疗关节炎的潜在药物。
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利用适配子抗病毒性肝炎的新型治疗策略
适配子(aptamer)指能与靶分子以高亲和力结合的配基,是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中通过反复"与靶分子作用-筛选-富集"过程而获得.
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适配子压电石英芯片再生性能研究
目的 探索适配子压电石英芯片佳再生试剂,对固定好的适配子型芯片保存性能进行检测.方法 用生物素-亲和素法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,分别用HCl、NaOH、EDTA、尿素、甲酰胺5种试剂对适配子芯片进行再生实验,选取较好再生试剂;将固定好的适配子芯片保存在PBS缓冲液(0.1%叠氮钠)中,对芯片的保存时间进行测定.结果 用EDTA对适配子芯片进行再生效果好,重复检测5次后芯片响应信号仍在第1次检测的＞90%,此外HCl也可对适配子芯片重复利用3次;固定好的适配子芯片在加入防腐剂的结合缓冲液中可长期保存,保存21 d后信号响应无明显下降.结论 与抗体压电传感器相比较,适配子压电传感器有一定优势,适配子芯片成本更低,再生能力强,固定好的芯片保存时间长,体现出适配子检测的优越性.
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适配子型压电石英晶体传感器检测人免疫球蛋白E的实验研究
目的 研制适配子型压电子石英晶体传感器阵列与常用的免疫分析方法 进行比较,以评价压电石英晶体传感器阵列检测灵敏度、特异性与临床检测的可行性.方法 以AT切型、基频10MHz的镀金石英晶体作为换能器,将抗人免疫球蛋白E适配子固定在石英晶体电极表面,用2×5检测池阵列构建新型适配子型压电石英晶体传感器;分别进行标准品及人血清免疫球蛋白E的检测,研究了检测灵敏度,特异性等检测指标.结果 该传感器可快速完成检测且无非特异性反应,在检测范围内传感器的响应特性良好,压电晶体频率偏移值与免疫球蛋白浓度呈良好的线性关系;将此免疫传感器用于人血清标本的测定,结果 与化学发光法符合(r值=0.9924).结论 研制的传感器阵列具有灵敏度高、特异性好,检测通量高,无需标记,操作简便,能实时在线检测等优点,可用于临床实验诊断,具有较高的临床推广应用价值.
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SELEX技术筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌适配子的研究
目的 利用指数富集的配体进化技术(SELEX)筛选耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的适配子,并研究适配子AM6与MRSA结合的特异性,为研发MRSA的特异性诊断试剂和靶向治疗药物打下基础.方法 体外构建81个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库；通过反复的SELEX筛选获得MRSA的适配子并进行一级结构分析；利用荧光显微镜和PCR扩增法鉴定AM6与MRSA结合的特异性.结果 经过20轮环筛选,获得了25个与预期大小相同的ssDNA序列,它们之间没有共同的保守序列；AM6仅与MRSA结合,而不与甲氧西林敏感葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRSCN)、甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌(MSSCN)、大肠埃希菌结合.结论 利用SELEX技术成功地筛选出MRSA的适配子,其中适配子AM6能特异性结合MRSA.
关键词： 指数富集的配体进化技术 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 适配子 -
适配子在口腔肿瘤诊断和治疗中的应用
适配子一经发现便得到了迅速的发展,几乎自然界存在的任何物质都能找到相应的适配子,包括病毒、金属离子、蛋白质分子甚至完整的细胞等.适配子能与靶分子的高特异性、高亲和力的结合,而且分子量小,免疫原性低,易于体外修饰等特点使得适配子在肿瘤治疗和诊断方面具有广阔的应用前景.但是在口腔颌面部恶性肿瘤治疗中的研究较少,本文将综述近年来适配子在口腔肿瘤方面的基础研究和应用.
关键词： 口腔肿瘤 适配子 指数式富集法配体系统进化技术 靶向治疗 -
炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的结构与亲和性分析
为了对炭疽芽孢杆菌疫苗株A.16R芽孢的适配子进行亲和性分析，体外构建了78个碱基的随机DNA库，以炭疽芽孢杆菌疫苗株A.16R芽孢为靶标，用SELEX技术进行了15轮的筛选，将筛选到的适配子库进行克隆、测序，用Macaw 2.05和DNA sis v2.5软件对每一适配子的保守序列和二级结构进行分析，并用生物素-链酶亲和素-辣根酶系统检测，根据OD值的高低判定亲和力的大小，对每一适配子进行亲和力测定。结果表明，适配子的亲和力高低不一，OD值高为1.2，低为0.25，二级结构分析结果显示，茎环和茎等二级结构可能是适配子与芽孢结合的基础；其一级结构提示有AGGGG、CCCCG、GGGTT、ACACT等保守序列，上述分类与OD值的高低分布基本吻合。
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SELEX法筛选炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的研究
目的:利用SELEX(system evolution of ligands by exponential enrichment)体外筛选技术,寻找能与炭疽芽孢杆菌芽孢特异结合的寡核苷酸适配子(aptamer).方法:体外合成长度为78个核苷酸的随机DNA库,通过SELEX技术,以炭疽芽孢杆菌疫苗株A.16R的芽孢为靶标进行15轮的筛选,利用生物素-亲和素显色系统判断寡核苷酸与芽孢的结合活性.结果:随着筛选轮数的增加,PCR扩增电泳条带逐渐单纯,寡核苷酸与芽孢结合后显色,D值提高了9倍以上,D值随适配子结合量的增加而递增.结论:已初步筛选到与炭疽芽孢具有亲和力的适配子.
