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SELEX技术检测小分子化学物研究进展
Tuerk等[1-2]于1990年发明一种体外筛选新技术,即指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment,SELEX),分别筛选出针对噬菌体T4 DNA聚合酶和有机染料分子的特异性适体.适体(aptamer)指用SELEX技术从体外合成的随机寡核苷酸序列库中人工筛选出的与靶标有高亲和力和特异性结合的寡核苷酸序列.
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利用适配子抗病毒性肝炎的新型治疗策略
适配子(aptamer)指能与靶分子以高亲和力结合的配基,是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术,从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中通过反复"与靶分子作用-筛选-富集"过程而获得.
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核酸适配子在生物医学领域中的应用
1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer).由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注.本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述.
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Developing aptamers into tumor diagnostics and therapeutics
Aptamers are small single-stranded nucleic acid molecules that bind a target protein with high affinity and specificity. Due to their stability, low toxicity and immunogenicity, as well as improved safety, aptamers are attractive alternatives to antibody and are therefore suitable for in vivo applications. Aptamers are typically isolated, through a process termed SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), from combinatorial libraries with desired proteins. In the present review, the recent non-conventional aptamer selection process will be discussed together with an overview on the aptamer application in cancer diagnosis and therapy.
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从靶标的多样性看核酸适配子在分子识别中的优势与前景
20世纪90年代初,Tuerk等[1]建立了一种新的组合化学技术--指数富集的配体系统进化技术(Systematic evolution of ligands bv exponential enrichment,SELEX),筛选到噬菌体T4 DNA聚合酶的RNA配体,即核酸适配子(aptamer).核酸适配子能与生物靶分子高特异性和高亲和力结合,功能上与抗体类似,在分子识别研究中具有重要价值,目前在生物医学各个领域的相关研究中均有应用.
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H22肿瘤细胞aptamer的筛选与结构分析
目的:获得与H22肿瘤细胞特异性结合的aptamer.方法:利用SELEX技术,以小鼠DC细胞为反筛选细胞,以H22肿瘤细胞为靶细胞,从体外合成的80bp随机单链DNA文库中筛选出能与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer.采用荧光标记引物法检测aptamer与H22肿瘤细胞的亲和力.所获得的aptamer采用MACAW v2.05软件进行aptamer序列的一级结构同源序列比较,用DNASIS v2.5软件计算分析序列低二级结构能量值,获得其二级结构模拟图.结果:本实验设计的文库序列:5'-CGTCGCTGCACATTCCG-N46-CGCACAGCTGGGA GTAC-3'具有较高的扩增效率,适合于aptamer与以细胞为靶物质的筛选.经过11轮循环筛选,随机单链DNA文库与靶细胞结合的荧光强度从1%上升到59%,结合曲线进入平台期,表明结合已基本处于稳定状态,因此可以判断aptamer与靶细胞的结合基本已经处于饱和状态.对所获得的32个aptamer进行测序,然后进行一级结构和二级结构分析.一级结构分析获得5个保守序列:AGGGA、AGAAGG、GTGAXAA、ATAGT、CAAGG,其余10个aptamer无同源序列.二级结构分析表明,aptamer形成的茎环、凸环结构可能是与H22肿瘤细胞特异性结合的结构基础.亲和力检测结果表明第24号aptamer具有强的亲和力.结论:利用随机单链寡核苷酸文库成功获得与H22肿瘤细胞特异结合的aptamer,其一级和二级结构与亲和力密切相关.
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SELEX实验中核酸-蛋白复合物分离方法对富集库亲和力的影响
目的比较SELEX实验中,核酸-蛋白复合物分离技术的差异对筛选富集库亲和力的影响.方法以β-转化生长因子Ⅱ型受体为靶目标,采用不同技术路线从ssDNA随机库中获取亲和富集库:技术路线1,靶目标预先被吸附到96孔微量滴定板后,再进行筛选,从滴定板上洗脱结合核酸;技术路线2,溶液中筛选、硝酸纤维膜截留核酸-蛋白复合物,从膜上回收结合核酸;通过膜结合测定、凝胶阻滞测定实验检测筛选富集库对靶目标的亲和力.结果经4轮筛选后,技术路线1来源的富集库与初始随机库相似,对靶目标无亲和力;而技术路线2来源富集库对靶目标的亲和力较初始随机库有显著提高.结论SELEX实验中,溶液中筛选、膜截留结合核酸的技术路线与固-液相筛选、固相中直接获取结合核酸的途径相比较,前一种方法更容易富集到与靶目标结合的目的序列.