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离子特异性DNA酶在人体重金属含量检测中的应用
20世纪90年代以来,研究人员逐渐发现了多种具有特定生物催化功能的DNA分子,即DNA酶.离子特异性DNA酶是上述DNA中特殊的一类.该酶是具有离子结合特异性的DNA分子片段[1-5],这些片段和某种特定离子结合后可以被活化成为一种核酸内切酶,能够将与之序列互补的核酸链切断[6-9],因此被称为离子特异性DNA酶.目前在分子诊断中一般通过多种方法筛选得到目的离子特异性DNA酶,随后构建相应的离子特异性DNA酶生物传感器(探针)用于离子浓度的检测.
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10-23DNA酶体外切割HBV前C/C区mRNA的初步研究
探讨10-23DNA酶对HBV前C/C区mRNA的体外切割活性.用克隆及亚克隆技术将HepG2215细胞中HBV前C/C区基因克隆入pCDNA3.1(+)载体,转录表达该区mRNA.合成针对HBV前C/C区2031位点的10-23DNA酶,观察其对靶mRNA的切割活性.10-23DNA酶对HBV前C/C区mRNA的切割效率与Mg2+离子浓度呈正相关.10-23DNA酶能有效切割HBV前C/C区mRNA.
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比较两种方法制备脱细胞小血管支架
目的:比较0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH和酶法制备脱细胞小血管支架的效果.方法:分别用含0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH处理3 d或1.0H Triton X-100+0.125%胰蛋白酶+Dnase+Rnase孵育48 h,脱去犬股静脉中的细胞成分,50Co辐照消毒,血清浸泡24 h,将平滑肌细胞和内皮细胞接种到脱细胞支架中;进行H-E染色、胶原纤维和弹力纤维染色,扫描电镜观察及力学检测.结果:0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH法完全地脱去了血管细胞;细胞外基质较完整地保留下来,其形态结构与脱细胞前无明显改变;见种植细胞在支架内生长良好,连成片,支架具有良好的生物相容性;力学结果显示其弹性回复率和大断裂强度好于酶组.结论:两种方法比较,0.5%Triton X-100+0.05%NH4OH法简便易行,成本低,脱细胞效果好,组织相容性佳,对力学性状影响小,是比较理想的制备脱细胞小血管支架的方法.
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联合化学诱导制备EB病毒特异性DNA酶
目的:探索EB病毒特异性DNA酶(EBV-DNase)可靠实用的制备方法,为建立一种新的鼻咽癌(NPC)血清学诊断方法--血清EBV-DNase抗体检测奠定基础. 方法:采用TPA+正丁酸联合化学诱导的方法诱导处理P3HR-1细胞株48 h,超声破碎,离心收集上清液即得EBV-DNase粗提物.用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及放免酶活性检测法测定粗提物中的EBV-DNase. 结果:①在SDS-PAGE凝胶上,与未经诱导的粗提物相比,诱导后的粗提物有多条增强表达的蛋白质带,尤以相对分子质量为52000的蛋白质更加明显.②用放免法酶活性测定时,经诱导的粗提物CPM值及根据公式计算的每毫升酶单位(U/ml)分别>17000和40,而对照物则≤2000和4.0. 结论:联合化学诱导方法能成功地使EBV-DNase在P3HR-1细胞株中增强表达,是一种制备EBV-DNase切实可行的方法.
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脂质体与腺病毒转染EDRz抑制自体移植静脉内膜增生的比较研究
目的 探讨以脂质体和腺病毒为载体,早期生长反应基因-1 DNA酶(Egr-1 DNA enzyme,EDRz)局部外用对自体移植静脉血管平滑肌(VSMC)增殖和内膜增生的抑制作用.方法 大鼠建立自体静脉移植模型后随机分为脂质体组、腺病毒组和对照组,两实验组分别用脂质体-EDRz和腺病毒-EDRz涂抹移植静脉行在体转染.于术后1,2,6,24 h及3,7,14,28 d取材,荧光显微镜检测移植静脉的转染情况；采用原位杂交方法检测Egr-1 mRNA的表达；用免疫组织化学方法检测Egr-1蛋白表达,同时进行组织形态学观察.结果 术后1h,EDRz主要位于移植静脉的外膜、中膜和部分内皮细胞.脂质体组荧光灰度值为70.3±13.5,腺病毒组荧光灰度值为60.5±11.2.术后2～24 h,EDRz主要位于移植静脉的中膜；移植7d,EDRz主要位于移植静脉的内膜.移植早期Egr-1蛋白表达主要位于中膜的血管平滑肌细胞( VSMC)和部分单核细胞、内皮细胞；移植后期未检测到Egr-1 DNA酶的表达.移植后期在中膜和新生内膜的VSMC均未检测到Egr-1蛋白的表达.移植2h阳性表达率,脂质体组为(15.3±4.2)％,腺病毒组为(20.7±2.6)％.脂质体组和腺病毒组与对照组比较,前两者VSMC的增殖程度和内膜厚度明显减轻.结论 EDRz通过减少Egr-1在自体移植静脉中的表达,可有效地抑制自体移植静脉中VSMC的增殖和内膜增生；脂质体转染优于腺病毒转染.
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抗狼疮散对系统性红斑狼疮患者血清DNA及DNase的影响
目的:探讨中药抗狼疮散对系统性红斑狼疮(SLE)患者血清DNA及DNase的影响.方法:40例SLE患者随机分为2组,治疗组(20例)给予抗狼疮散结合泼尼松治疗,对照组单纯(20例)给予泼尼松治疗,共3个月,检测治疗前后两组患者血清DNA及DNase水平,同时检测30例正常人血清.结果:SLE患者血清DNA水平明显高于正常人(P＜0.05),DNase水平明显低于正常人(P＜0.05).治疗后,治疗组血清DNA及DNase水平与对照组比较差异无显著性(P＞0.05).结论:抗狼疮散对SLE患者血清DNA及DNase无影响,它可能通过其它途径发挥治疗SLE的作用.
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人绒毛膜滋养层细胞的培养
取妊娠6～ 10周的人妊娠早期绒毛膜,用胰酶/DNA酶消化,换瓶纯化处理,经光镜和电镜检测证实,我们建立了稳定的人绒毛膜滋养层细胞培养体系.
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Egr-1DNA酶抑制自体移植静脉内膜增生的实验研究
目的 探讨早期生长反应基因-1 (Egr-1) DNA酶(Egr-1 DNA enzyme,EDRz)对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和内膜增生的抑制作用,从而证实基因治疗静脉移植后狭窄、闭塞的可行性.方法 构建EDRz,建立自体静脉移植模型,将大鼠右颈总静脉端-端吻合于肾下腹主动脉,EDRz转染移植静脉,分别于移植后1、2、6、24 h及3、7、14、28、42 d切取移植静脉标本,每个时相按随机数字表法随机抽取10只大鼠.荧光显微镜下观察EDRz转染移植静脉情况;应用原位杂交和RT-PCR方法检测Egr-1 mRNA的表达；应用Western蛋白印迹和免疫组织化学方法检测Egr-1蛋白表达情况；HE染色光镜下观察组织学形态.结果 ①EDRz转染移植静脉情况:移植后1h时,EDRz主要位于移植静脉的外膜、中膜和部分内皮细胞;2、6及24 h时,EDRz则主要位于移植静脉的中膜；7d时,EDRz主要位于移植静脉的内膜; 14、28及42 d时未检测到EDRz的表达.②Egr-1 mRNA表达结果.RT-PCR检测结果:转染EDRz后1h时,Egr-1 mRNA表达出现高峰,2、6及24 h表达下降,3d时表达微弱,移植后7、14、28及42 d未见Egr-1 mRNA的表达,转染EDRz后1h时Egr-1 mRNA表达明显高于其余各时相(P＜0.01).原位杂交检测Egr-1 mRNA表达的变化趋势与RT-PCR结果基本一致.③Egr-1蛋白表达结果.Western蛋白印迹结果:正常静脉中未检测到Egr-1蛋白阳性表达.转染EDRz后2h时,出现Egr-1蛋白阳性表达,6h、24 h及3d时其表达逐渐降低,移植后1h时和移植后7、14、28及42 d时未见Egr-1蛋白阳性表达.移植后2h时的Egr-1蛋白表达的吸光度值高于其他时相(P＜0.01).免疫组织化学方法检测的Egr1蛋白阳性表达的变化趋势与Western蛋白印迹结果基本一致.④EDRz转染移植静脉与未转染同期相比VSMC的增殖程度和内膜厚度明显减轻.结论 EDRz通过减少Egr1在自体移植静脉中的表达,可有效地抑制自体移植静脉中VSMC增殖和内膜增生,可用来防治自体静脉移植后所导致的血管狭窄、闭塞.
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汉族急性心肌梗死患者DNA酶Ⅰ基因多态性与血脂、血糖的关系研究
目的:探讨汉族急性心肌梗死患者DNaseⅠ基因A2317G位点的基因型及与血脂、血糖的关系.方法:应用PcR - LoR法分析汉族急性心肌梗死患者DNaseⅠ基因多态性,计算各基因型分布频率,不同基因型与空腹血糖、血脂的相关性.采用sAs软件进行统计分析.结果:汉族AMI患者中DNA酶摹基因A2317G位点基因型和等位基因频率分布符合Hardy-weinberg平衡定律,A2317G位点等位基因频率分别为0.52、0.48,不同基因型的血酯、血糖水平差异无统计学意义(P＞0.05).结论:AMI患者中A2317G位点等位基因频率与与亚洲人群中的蒙古人、日本人相似,而与韩国人、土耳其人、纳米比亚人和德国人明显不同,DNaseⅠ基因多态性具有显著的种族异质性.
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汉、维族急性心肌梗死患者DNA酶Ⅰ基因多态性研究
脱氧核糖核酸酶Ⅰ (DeoxyribonucleaseI,DNase Ⅰ)是早发现的一种特异性核酸内切酶,是一种38KDa的糖蛋白,作用于双链DNA的磷酸二酯键,产生带有5'-磷酸、3'一羟基末端的寡核苷酸,其活性依赖于Mg2+和Ca2+等二价阳离子的存在.初在消化道中被发现,一度认为它仅是一种消化酶,作用是为体内核苷酸的补救合成途径提供寡核苷[1-2].本文应用PCR-LDR法检测DNase Ⅰ基因A2317G位点的基因型,分析汉、维族急性心肌梗塞患者的基因多态性特点.
