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宏基因组学技术及其在微生物学研究中的应用
自然环境中超过99%的微生物不能用传统的方法进行纯培养,这大大限制了人类认识微生物世界的视野。宏基因组学是20世纪90年代发展起来的,它是通过直接提取环境中全部微生物的总基因组DNA并克隆到合适的可培养微生物宿主中来筛选目的基因的新方法。它已广泛应用于农业、林业、土壤、海洋、人体医学等各个领域,从发酵工艺到生物能源再到环境治理等与人们生活息息相关的各个方面都起到突出的作用。本文重点介绍了宏基因组学在微生物学研究中的应用,旨在说明宏基因组技术可以获得难以人工培养的微生物基因组信息,这使我们在很大程度上提高了对环境中微生物资源多样性的认识,并使其极大的为人类有效开发利用。
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定量PCR技术快速分析噬菌体展示肽库的应用
目的 建立无需转染菌株的快速定量方法,用以分析噬菌体展示肽库筛选.方法 选取Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库,进行梯度稀释并提取基因组,在其载体序列上设计一对通用引物,运用SYBR Green的方法进行荧光定量PCR扩增,通过计算该方法的特异性、精密度和线性范围来确定该检测方法的可行性.结果 通过溶解曲线得知该对引物可特异性筛选噬菌体展示七肽库.通过计算每个浓度的Ct值及其偏差可发现,该体系在2×104pfu/mL~2×1010pfu/mL的浓度范围内线性关系良好,且在2×105pfu/mL~2×1010pfu/mL的浓度范围内批间不精密度小于15%.结论 建立的荧光定量PCR体系可以避免转染菌株所带来的繁琐人工劳动,并可以特异、准确、快速的对噬菌体展示肽库进行定量分析.
关键词: 噬菌体展示 实时荧光定量聚合酶链反应 文库筛选 -
噬菌体展示技术筛选HBV前-前-S抗原基因启动子结合蛋白基因
目的:筛选乙型肝炎病毒(HBV)前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白.方法:应用噬菌体表面展示技术,以HBV前-前-S抗原基因启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,并对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的43个克隆中得到20个与HBV前-前-S抗原基因启动子特异结合的阳性克隆,包括人类SMG-1的磷脂酰肌醇3相关激酶激酶、28S核糖体、单倍型As2A线粒体、组氨酰-tRNA合成酶、脂肪醛脱氢酶、桥粒相关蛋白、MAX相互作用蛋白1等17个已知功能基因及3个未知功能基因.结论:用噬菌体人肝细胞cDNA文库筛选得到HBV前-前-S抗原基因启动子的结合蛋白基因,为进一步研究HBV发病机制创造了新的途径.
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应用噬菌体展示技术筛选HBsAg启动子I的DNA结合蛋白
目的:通过筛选HBsAg基因启动子I(SPI,surface promoter I)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径.方法:应用噬菌体展示技术,以HBsAg基因启动子I的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索.结果:噬菌体经富集后,从随机筛选的14个克隆中得到8个阳性克隆,成功构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV表面抗原基因启动子I特异结合的肝细胞蛋白,共编码7种蛋白.其中3个克隆编码未知功能蛋白;其余的克隆分别编码4-氨基丁酸氨基转移酶、触珠蛋白、复制蛋白等蛋白.结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBsAg基因启动子I的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因.
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核酸适配子在生物医学领域中的应用
1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer).由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注.本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述.
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筛选cDNA文库获取肿瘤相关基因
全文介绍普通cDNA文库、消减cDNA文库与时间间隔cDNA文库(TSS cDNA文库)进行核酸探针杂交筛选、免疫学筛选目的基因及其片段的方法和相关的新进展;对cDNA文库在肿瘤相关基因研究方面的具体应用作了简单的举例说明.
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表达谱基因芯片技术及其在兽医学上的应用
20世纪90年代初兴起的人类基因组计划(HGP),其研究重点现已从结构基因组迈向了功能基因组的研究.揭示生命的本质,阐明基因的功能是后基因时代的重要任务,随之而产生的基因芯片(gene chip)技术,为功能基因组学研究提供了强有力的手段.由于基因芯片具有高通量和平行检测等特点,所以该技术自1989年提出并取得国际专利以来[1-2],已经在基因组测序、基因表达及功能分析、基因文库筛选、基因突变检测及基因多态分析、新药物的筛选开发、病原体检测及致病机制研究等方面得到了广泛的应用.这些应用可归分为两大类,一是研究基因的型,即利用基因芯片进行序列分析以及序列的突变和多态性研究;二是对功能基因组的表达进行分析,即表达谱基因芯片的应用.
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应用混合探针文库筛选法克隆多个肿瘤差异表达基因
目的:进一步分离在鼻咽癌组织中表达下调/缺失的候选抑瘤基因.方法:采用PCR方法对有差异表达的cDNA序列(AF152605和AF091517)进行探针标记,Northern杂交确定其mRNA转录本大小,进而混合两种PCR探针对骨骼肌cDNA文库进行筛选,阳性克隆经PCR鉴定后直接测序.结果:克隆了转录本为2.2Kb、1.1Kb和1.4Kb三个基因,GenBank登录号分别为AF179285、AF170307和AF194971.结论:混合探针文库筛选法是同时、快速获得多个cDNA片段其全长序列的可借鉴实验手段.
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生物素标记文库筛选与cDNA快速终末端扩增技术克隆HRNT-1新基因
目的:大鼠ZA73基因(GenBank accession number: AF011363)是本实验室从大鼠支气管上皮恶性转化细胞模型中采用mRNA差异显示技术克隆到的EST片段,与支气管上皮细胞恶性转化相关.根据此EST序列,克隆人全长基因.材料与方法: 运用生物素标记探针筛选人cDNA文库、将筛选基因进行cDNA快速终末端扩增(Rapid amlification of cDNA ends),直至获得全长序列.结果:HRNT-1cDNA总长4256bp,开放阅读框架2760bp,5′非编码序列253bp,3′非编码序列1240bp,已被GenBank收录于Nr数据库中( Accession number:AF223393).结论:采用生物素标记cDNA文库筛选和 cDNA快速终末端扩增相结合的技术是克隆全长cDNA快速而有效的方法,尤其适用于那些长度超过2kb的基因.
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非同位素标记双向杂交法筛选差减文库
目前用于差减文库筛选的方法有多种,其共同的缺陷在于敏感性低,而且多数是运用同位素法进行的,具有一定的损伤性.我们运用DIG法标记双向差减文库探针进行差减文库筛选.1 材料与方法1.1 差减文库运用PCR SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech公司)构建3个差减文库,即以腺瘤为检测cDNA、远端粘膜为驱赶cDNA的差减A-N文库;以腺癌为检测cDNA、远端粘膜为驱赶cDNA的差减T-N文库;以腺癌为检测cDNA、腺瘤为驱赶cDNA的差减T-A文库.所用载体为pGEM-T Easy Vector(Promega公司),分子量为3015 bp.插入片段的两端带有接头序列,其中含有PCR扩增的引物序列,包括NP1引物:5′-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3′;NP2R引物:5′-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3′.
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宏基因组学及其技术的研究进展
宏基因组学是研究生态群体基因功能和其相互作用的新科学领域,以特定生态环境中微小生物遗传物质的总和作为研究对象,基本研究策略是通过克隆、异源表达,筛选出有用的新基因及其产物.宏基因组学为生命学科和药学研究提供了一个强有力的新技术,并在包括医学在内的许多领域取得了新成就.本述评对宏基因组学的概念、技术和应用作了简要介绍.