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噬菌体展示技术对金黄色葡萄球菌IsdB蛋白抗原表位的分析
金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)感染已经成为世界难题,其耐药性的迅速出现及传播更加剧了它的危害.S.aureus疫苗研究中,一些表面蛋白具有较好的免疫原性,可作为疫苗候选物.IsdB是一种表面蛋白,具有较好的免疫原性,其抗原表位的确定对于以此蛋白为基础的单一蛋白疫苗或融合蛋白疫苗的研究和制备有很大意义.本论文以IsdB的单克隆抗体3B6株McAb为配基,从噬菌体随机七肽库中筛选抗体识别的模拟肽.经测序及序列比对分析,发现IsdB的抗原表位为空间构象,集中在NEAT结构域前端.本研究对于IsdB疫苗的研究具有一定的参考价值.
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丝状噬菌体pⅧ展示系统表达赭曲霉毒素A模拟表位及应用研究
目的 传统赭曲霉毒素A(OTA)竞争抗原毒性强、成本高、制备难度大.将OTA模拟表位展示于丝状噬菌体pⅧ表面,获得无毒、易于制备的OTA竞争抗原替代物.方法 构建带有OTA模拟表位的重组噬菌粒pC89-COTA,为了提高OTA模拟表位与抗体的结合率,在OTA模拟表位序列5’端引入了肠激酶酶切位点.噬菌粒转化进大肠杆菌XL1-blue后再经野生KM13噬菌体感染,获得带有OTA模拟表位的重组噬菌体.用该噬菌体代替竞争抗原建立OTA的无毒ELISA分析方法.结果 成功表达出带有OTA模拟表位的重组噬菌体,经肠激酶酶切的OTA模拟表位噬菌体与OTA抗体的结合效率显著高于未酶切的噬菌体.利用酶切后的噬菌体建立OTA的无毒ELISA分析方法,其低检出限为100pg/ml,线性范围为250pg/ml～1000pg/ml.进行加标回收实验,回收率为99.8％ ～ 112.3％,相对标准偏差为8.19％ ～11.64％,测试16份市售样品,阳性率为31.25％.结论 成功表达了OTA模拟表位噬菌体,建立了OTA的无毒ELISA检测方法.
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结核分枝杆菌环七肽配体分子的筛选和鉴定
目的 基于噬菌体展示随机环七肽库,通过亲和筛选获得结核分枝杆菌(MTB)环七肽配体分子,初步鉴定其与分枝杆菌的结合能力,以优化纳米检测.方法 以MTB标准株H37Rv灭活菌体为靶分子,卡介苗(BCG)为反筛分子,对噬菌体展示随机环七肽文库进行筛选.4轮淘选后,挑选H37Rv和BCG洗脱单噬菌体进行测序,ELISA检测单噬菌体与其亲和力将高亲和力单噬菌体所展示环肽进行体外合成,并标记荧光,荧光显微镜与流式细胞仪检测合成环肽的结合活性,并与前期获得的线性结合肽进行比较.结果 经过4轮亲合淘选,能与靶分子结合的噬菌体明显富集.单噬菌体测序共获得16种共同序列.ELISA检测显示,单噬菌体SB1、SB5、SB8、SB26与H37Rv和BCG的亲和力均较高,其吸光度值(A450)与阴性对照吸光度值(A450)比≥2.1,与3种非分枝杆菌不结合,确定为阳性克隆.流式细胞仪检测结果显示,H37Rv与环肽SB1、SB5、SB24、SB26结合的阳性细胞率分别为(73.2±6.3)％、(63.2±5.3)％、(32.9±3.1)％、(89.4±7.0)％;BCG与这4种环肽结合的阳性细胞率分别为(65.6±6.1)％、(48.6±4.5)％、(10.3±1.8)％、(86.6±7.9)％,H37Rv和BCG与4种环肽结合的阳性细胞率均高于H8[(4.0±1.0)％、(5.5±1.2)％].荧光显微镜观察结果显示,环肽SB1、SB5、SB24、SB26荧光肽均与H37Rv发生结合,荧光强度较强,与其他18种分枝杆菌均有一定的亲和力,但荧光强度弱于H37Rv,与3种非分枝杆菌均不结合.结论 本研究以环七肽库替代线性七肽库,成功筛选获得新的MTB配体分子,其与分枝杆菌的亲和力提高.
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中药有效成分作用靶点研究的策略与实践
中药治疗疾病的物质基础、药效和机制研究已较充分,然而靶点的研究进展相对缓慢,这和靶点研究本身的被动性和难度有一定关系.本文基于国内外文献报道,并结合笔者的研究实践,对此进行了较为系统的探讨.本文主要介绍三种技术路径:“线索”驱动、噬菌体展示以及亲和垂钓.并提及两种方案:酶解法和光交联法.基于这些技术方案,加强中药有效成分靶点研究的实践,将会有助于阐明中药治疗疾病的现代科学基础,有助于发展现代中药和创新中药.
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流感病毒神经氨酸酶广谱抑制多肽的筛选研究
以纯化的流感病毒颗粒H1N1、H3N2为靶点对噬菌体展示的随机12肽库进行了筛选.经ELISA、神经氨酸酶抑制活性鉴定,获得52个阳性噬菌体克隆.根据测序和氨基酸序列分析,挑选出不同克隆间同源性高的6条多肽进行化学合成.神经氨酸酶抑制活性实验显示,6条多肽中54-N1和69-N2的抑制活性强,对N1、N2和乙型流感病毒三种流感病毒神经氨酸酶均有明显的抑制活性,54-N1的IC50值为7.486～14.693 μmol/L,69-N2的IC50值为6.605～13.007 μmol/L.同时,54-N1和69-N2可抑制流感病毒在MDCK细胞中的生长.病毒空斑抑制实验显示,54-N1和69-N2可明显抑制空斑形成的大小和数目.通过分析,54-N1的IC50值为18.38～31.76 μmol/L,69-N2的IC50值为16.56～25.49 μmol/L.两条多肽的浓度在高达10mmol/L时仍对细胞无任何毒性.54-N1和69-N2作为新的流感病毒神经氨酸酶抑制剂,与现有NA抑制剂Oseltamivir进行了比较和讨论,为进一步研制局部应用的广谱抗流感病毒的鼻腔喷雾剂奠定了基础.
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定量PCR技术快速分析噬菌体展示肽库的应用
目的 建立无需转染菌株的快速定量方法,用以分析噬菌体展示肽库筛选.方法 选取Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库,进行梯度稀释并提取基因组,在其载体序列上设计一对通用引物,运用SYBR Green的方法进行荧光定量PCR扩增,通过计算该方法的特异性、精密度和线性范围来确定该检测方法的可行性.结果 通过溶解曲线得知该对引物可特异性筛选噬菌体展示七肽库.通过计算每个浓度的Ct值及其偏差可发现,该体系在2×104pfu/mL～2×1010pfu/mL的浓度范围内线性关系良好,且在2×105pfu/mL～2×1010pfu/mL的浓度范围内批间不精密度小于15％.结论 建立的荧光定量PCR体系可以避免转染菌株所带来的繁琐人工劳动,并可以特异、准确、快速的对噬菌体展示肽库进行定量分析.
关键词： 噬菌体展示 实时荧光定量聚合酶链反应 文库筛选 -
噬菌体抗体库技术的构建及应用研究进展
噬菌体抗体库(phage antibody library)技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术.噬菌体抗体库技术的基础,噬菌体展示技术,发展自上世纪80年代中期.1985年,美国密苏里大学的Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段加以改造.Smith将EcoRⅠ内切酶的部分基因片段与pⅢ基因融合,获得的重组噬菌体可在体外稳定增生,同时表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.随后,Parmley等[2]将已知抗原决定簇与pⅢ的N端融合呈现在表面,可被抗体特异性选择,从而提出了通过构建随机肽库以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.
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针对大量噬菌体展示短肽序列的生物信息学分析策略的构建
目的 建立一种生物信息学分析预测方法,针对通过噬菌体展示技术获得的大量短肽信息,从中筛选出所需的目的 功能蛋白. 方法 对应用噬菌体展示技术筛选脂多糖刺激的人外周血单核巨噬细胞株(THP-1)细胞获得的1263个七肽序列进行去冗余分析,结合混洗算法和随机排列检验(RPT),统计非冗余七肽序列中特定三肽的丰度及其显著性.利用Clustal W软件对包含丰度具有显著性的三肽的七肽序列进行多序列比对分析,并根据氨基酸的性质,寻找特征性短肽,通过在线BLAST软件与SWISS-PROT蛋白序列数据库进行同源性分析,获得包含这些特征性短肽的已知蛋白,进一步应用SignalP和TMHMM软件预测其中的分泌蛋白和膜蛋白,并终获得候选蛋白. 结果 得到TNF-α、toll样受体6(TLR-6)等炎性反应相关的细胞因子和膜蛋白及其表位模拟肽,为脓毒症等炎性反应相关疾病的研究和治疗提供依据. 结论 建立了一种生物信息学分析预测方法,该策略的建立为通过噬菌体展示技术筛选得到的短肽序列的分析提供一个全新的平台.
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抗细粒棘球蚴人工重组B抗原人源单链可变区抗体的筛选与在原核系统中的表达
目的筛选并表达抗细粒棘球蚴人工重组B抗原(r-AgB)的人源单链可变区抗体(ScFv),为细粒棘球蚴B抗原蛋白质功能的研究及包虫病的基因治疗开辟新途径. 方法采用噬菌体表面展示技术,以重组纯化的细粒棘球蚴B抗原为固相抗原,经过5轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选过程,从半合成的噬菌体抗体库中获得了抗原结合活性和特异性较强的含抗r-AgB的ScFv基因片段的阳性克隆,提取质粒,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后,亚克隆到pCANTAB5E载体上,转化大肠杆菌XL1-Blue,经IPTG诱导,表达可溶性ScFv. 结果筛选得到的ScFv片段基因为768 bp,经SDS-PAGE鉴定,在大肠杆菌XL1-Blue中表达的ScFv分子质量约28 ku,经过ELISA和Western-Blot检测,该单链抗体具有较强的抗原结合特性和特异性. 结论细粒棘球蚴重组B抗原人源单链可变区抗体筛选和表达成功,为今后包虫病人源抗体的研究和应用奠定了基础.
关键词： 噬菌体展示 人源单链可变区抗体 细粒棘球蚴重组B抗原 表达 -
用噬菌体展示技术筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白基因结合蛋白的研究
目的 筛选幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白(CagA)基因结合蛋白,探索CagA致病机理. 方法 应用噬菌体展示技术,以幽门螺杆菌CagA基因片段作为固相筛选分子,对噬菌体人胃细胞cDNA文库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"富集,噬斑裂解液PCR扩增后,进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索,确定编码结合蛋白的种类. 结果 噬菌体经富集后,筛选出36个阳性克隆,构建了克隆载体.序列测定后经过同源性搜索,确定幽门螺杆菌CagA基因共编码核纤层蛋白B1和胰岛素样生长因子结合蛋白2两种已知蛋白. 结论 用噬菌体人胃cDNA文库筛选得到幽门螺杆菌CagA基因DNA结合蛋白,为研究CagA致病机理,幽门螺杆菌疫苗的研制和治疗等提供依据.
关键词： 噬菌体展示 幽门螺杆菌 细胞毒素相关蛋白(CagA) 结合蛋白 -
CD28噬菌体展示及其生物活性检测
目的以噬菌体展示具有天然结构的人CD28分子胞外区同二聚体,检测其抗原性和生物活性,为CD28拮抗性类肽的筛选奠定基础.方法 RT-PCR从Jurkat细胞扩增CD28胞外区,将其克隆入噬菌粒载体pComb3HSS,构建的重组载体电转入受体菌XL1-blue,并加辅助噬菌体VCSM13,使CD28胞外区展示在噬菌体表面.以ELISA、流式细胞仪检测噬菌体展示CD28的抗原性和与B7-1的结合力.MTT法检测噬菌体展示CD28的生物活性.结果成功构建表达人CD28分子胞外区同二聚体的重组噬菌粒载体pComb3H-CD28,并以噬菌体展示系统展示CD28分子.ELISA和FCM结果显示,噬菌体展示CD28可与抗CD28抗体特异性结合,也可与Jurkat细胞表面CD28竞争结合抗CD28抗体,具有CD28抗原性.噬菌体展示CD28可与B7-1特异性结合,也可与Raji细胞表面CD80结合,具有与配体结合能力.体外生物活性实验显示,噬菌体展示CD28可抑制抗CD28抗体刺激的人外周血淋巴细胞增殖反应.结论利用噬菌体展示系统成功展示CD28同源二聚体,噬菌体展示CD28具有抗原性及生物活性,为以CD28为靶点体外筛选CD28拮抗性类肽,从而防治移植排斥反应和自身免疫病奠定了基础.
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幽门螺杆菌UreB抗原表位预测及其有效表位噬菌体展示的筛选
目的 筛选幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)分子中的抗原表位,为研制多抗原肽(MAP)疫苗奠定基础.方法 采用生物信息学技术对UreB的T细胞和B细胞表位进行预测和分析.构建ureB基因原核表达系统,Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组表达产物rUreB,常规皮内免疫法制备兔抗血清.选择UreB主要T细胞和B细胞联合表位肽并构建其噬菌体展示系统,PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体,SDS-PAGE鉴定目的重组PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化抗Hp全菌IgG和rUreB抗血清为一抗,采用Western blot对上述表位肽进行鉴定和筛选.结果 与GenBank中相关序列比较,所克隆的ureB基因核苷酸和氨基酸相似性分别为96%～99.5%和96%～100%.rUreB表达量约为细菌总蛋白的52%,提纯后仅见单一蛋白条带.预测的4个主要表位肽UreB230、UreB322、UreB479和UreB527在M13噬菌体中获得成功表达,采用不同一抗的Western blot均显示相似的阳性结果,但UreB322和UreB527反应强度明显高于UreB230和UreB479.结论 本研究成功地构建ureB基因高效原核表达系统和UreB主要T细胞和B细胞联合表位肽噬菌体展示系统.所采用的生物信息学技术可有效地预测抗原表位.UreB322和UreB527是UreB有效抗原表位,可作为幽门螺杆菌MAP疫苗的候选表位.
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用噬菌体蛋白Ⅸ展示抗HBsAg分子Fab段
目的用丝状噬菌体外壳蛋白Ⅸ(pⅨ)展示抗体Fab段,并与外壳蛋白Ⅲ(pⅢ)展示效果进行比较. 方法采用PCR方法钓取噬菌体蛋白Ⅸ基因,构建pⅨ展示抗乙肝表面抗原Fab的表达载体,制备噬菌体抗体,鉴定其抗原结合活性和Fab呈现水平,观察了噬菌体洗脱回收效率,并与pⅢ展示进行比较. 结果噬菌体pⅨ可以展示有功能活性的抗体Fab段,但对Fab的展示率低于pⅢ,展示率的高低可能与pⅨ展示的外源蛋白分子量大小有关."结合-洗脱-回收"实验显示,酸洗脱法回收的Fab-pⅢ噬菌体的感染活性大为下降,而对Fab-pⅨ噬菌体无影响. 结论 pⅨ成功展示Fab段,讨论了pⅨ展示体系可能具有的优越性.
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幽门螺杆菌黏附素A有效T和B联合抗原表位噬菌体展示和抗原性测定
目的 分析并确定幽门螺杆菌黏附素A(HpaA)分子中有效T细胞和B细胞联合(T/B)抗原表位.方法 重组表达HpaA(rHpaA)并免疫家兔制备抗血清.采用生物信息学技术预测和分析HpaA分子中T细胞和B细胞表位,PCB扩增T/B联合表位肽片段并构建其噬菌体展示系统.采用PEG/NaCl沉淀法提纯展示了T/B联合表位的重组噬菌体PⅢ蛋白(rPⅢ).分别以商品化幽门螺杆菌全菌IgG抗体和rHpaA抗血清为一抗,采用Western blot和ELISA对rPⅢ蛋白中展示的T/B联合表位进行筛选和鉴定.采用MTT检测rHpaA免疫小鼠脾细胞在不同重组噬菌体蛋白刺激下的增殖情况.结果 HpaA分子中共有5个T/B联合表位:HpaA10、HpaA37、HpaA79、HpaA116和HpaA143.所有T/B联合表位均成功地展示于M13噬菌体PⅢ蛋白表面.Western blot、ELISA和淋巴细胞增殖试验结果 均显示,HpaA116是优势抗原表位,HpaA37和HpaA79为有效抗原表位,HpaA10和HpaA143为无效抗原表位.结论 本研究成功地构建了幽门螺杆菌HpaA的T/B联合表位肽噬菌体展示系统.HpaA37和HpaA79,尤其是HpaA116是HpaA有效T/B联合抗原表位.
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人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定
目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.
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幽门螺杆菌外膜蛋白GroEL优势T-B联合抗原表位的鉴定
目的 筛选并鉴定幽门螺杆菌外膜蛋白GroEL的优势T细胞和B细胞(T-B)联合抗原表位.方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌NCTC11637株groEL基因并构建其原核表达系统,SDS-PAGE检查目的重组蛋白rGroEL表达情况.Ni-NTA亲和层析法提纯rGroEL.采用激光共聚焦显微镜法检测幽门螺杆菌NCTC 11637和SS1株中GroEL分布.Triton X-114法提取上述菌株外膜蛋白样本,采用Western blot法检测外膜蛋白样本中的GroEL.采用专业生物信息学软件预测GroEL的T-B联合抗原表位并构建其噬菌体展示系统.采用Western blot法和ELISA分别检测含T-B联合表位肽的重组噬菌体PⅢ蛋白和人工合成的T-B联合表位肽的免疫反应性.结果 幽门螺杆菌NCTC11637和SS1株groEL基因核苷酸和氨基酸序列相似性高达97.68％～99.63％.所构建原核表达系统能有效表达可溶性rGroEL.GroEL定位于幽门螺杆菌NCTC11637和SS1株外膜.GroEL168、GroEL258、GroEL288、GroEL365、GroEL396和GroEL438六个主要的预测T-B联合抗原表位中,GroEL168显示了很强的阳性杂交信号.ELISA结果显示,GroEL168免疫反应性强(P＜0.01),其次为GroEL258和GroEL288 (P＜0.05).结论 GroEL是幽门螺杆菌外膜蛋白.GroEL168是GroEL的优势T-B联合抗原表位,可用于制备幽门螺杆菌多抗原肽疫苗.
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人源抗戊型肝炎病毒单克隆抗体的获得与鉴定
目的获得人源中和性抗戊型肝炎病毒(HEV)单克隆基因工程抗体. 方法采用五轮筛选法(逐轮降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的4种含中和抗原表位的HEV 代表株ORF2重组混合抗原淘筛本室构建的HEV 患者外周血源的噬菌体抗体库.获得有特异结合活性的噬菌体抗体,酶切鉴定抗体基因插入.切去噬菌粒上衣壳蛋白gⅢ基因构建表达载体,在大肠杆菌中可溶性表达抗HEV抗体Fab段,ELISA、Western blot检测抗体免疫学活性;测序分析抗体基因. 结果筛选出4株与含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异结合而与BSA、HBsAg无交叉结合反应的噬菌体抗体,可能为中和抗体.切去gⅢ基因,在大肠杆菌中表达可溶性抗体Fab段,表达量在细菌培养液上清和细菌裂解液中差异无显著性.可溶性抗体与含中和抗原表位的HEV ORF2重组混合抗原有特异结合活性,与BSA、HBsAg无交叉结合反应.Western blot显示在相对分子质量(Mr)略大于45×103处有一明显条带,与Mr 48×103的Fab大小一致.DNA测序分析表明,Fab段VH属于IgG VH3基因家族,VL属于Vκ1基因家族. 结论利用噬菌体抗体库技术成功获得抗HEV的人源单克隆抗体.
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抗HBsAg/RBC双特异噬菌体抗体的构建
目的通过不同外壳蛋白的展示,构建抗HBsAg/RBC双特异噬菌体抗体. 方法通过DNA重组技术,将抗HBsAg Fab与噬菌体基因8融合,抗RBC ScFv与噬菌体基因3融合,这2种融合基因以不同的启动子驱动,并克隆于同一噬菌体表达载体上,得到双特异噬菌体抗体表达载体,转化大肠杆菌后获取噬菌体抗体上清,用ELISA和红细胞凝集试验检测其双特异活性. 结果 ELISA和RBC凝集实验证明,本方法可形成双特异噬菌体抗体,可使含有HBsAg的RBC悬液产生凝集.用展示性能得到提高的蛋白8变种取代野生型蛋白8可提高双特异噬菌体抗体的活性. 结论 HBsAb和RBC两种抗体分子能够通过不同噬菌体外壳蛋白同时展示于同一噬菌体表面,形成双特异噬菌体抗体.可用于人外周血HBsAg的快速血凝法检测.
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人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选
目的 构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体.方法 用RT-PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.结果 17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为6.93×107的抗体库,滴度为8×1014 PFU/ml,Fab基因重组率为40%.以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性.结论 成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体.
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噬菌体随机展示肽库及其应用
噬菌体随机展示肽库是一类利用丝状噬菌体发展起来的多肽文库.通过噬菌体展示技术,目前人们已能借助此类文库研究包括抗原决定簇的鉴定、疾病的诊断与治疗等许多领域的诸多关键性问题.本文简介此类文库的基本作用原理及应用.
