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人源性bFGF单链抗体的筛选、表达及鉴定
目的 用重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)筛选大容量人源噬菌体抗体库,获得能与bFGF特异性结合的人源性单链抗体(scFv).方法 用rhbFGF对大容量人源噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选,并通过phage ELISA法对随机挑选的克隆进行抗原结合活性测定,得到的阳性克隆进一步进行原核可溶性表达及鉴定.结果 从104个随机挑选的克隆中,筛得39株抗bFGF的抗体,通过对抗体可变区基因进行多样性分析,发现存在8种不同抗体可变区基因,挑选其中8株phage ELISA显色高的克隆进行酶切和测序鉴定,发现其中7株为正确的抗体基因序列,通过大肠杆菌成功的进行了scFv的可溶性表达,通过竞争ELISA发现其中一株scFv能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1βⅢC的结合.结论 通过筛选噬菌体抗体库获得到7株抗bFGF特异性抗体,其中一株抗体能够抑制bFGF与其高亲和力受体FGFR1的结合.
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人源性抗HBsAg单链Fab基因在酵母中的表达
抗乙肝表面抗原的人源性抗体(Fab)在临床上有防治乙型肝炎病毒的应用前景,如用于预防新生儿乙型肝炎病毒的垂直传播和治疗性乙肝制剂等.本文将噬菌体抗体库筛选得到的人源性抗HBsAg Fab抗体基因,通过重叠PCR的方法借Linker将Fab的轻链(L链)和重链(H链)融合构建单一的链,即单链Fab(Single chain Fab)基因,并插入到酵母表达载体pPICZαA中.将构建的表达载体质粒pPICZαA-HL线性化,通过LiCl转化法转化毕赤酵母GS115,利用ZeocinTM抗生素筛选重组酵母,并用高剂量的ZeocinTM平板来筛选多拷贝整合有融合L、H链基因的重组酵母.
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B淋巴细胞激活因子的全人源抗体对BAFF生物学活性的拮抗作用
通过注射人B淋巴细胞激活因子(hsBAFF)的全人源抗体scFv-Fc,观察其对hsBAFF引发的B细胞增殖与分化的拮抗作用.将ICR小鼠随机分为对照组、hsBAFF(1 mg·kg- 1)组、hsBAFF(1 mg·kg-1)+Ab(1 mg·kg-1)组、hsBAFF(1 mg·kg-1)+ Ab(2 mg·kg- 1)组、hsBAFF(1 mg·kg-1)+ human IgG(1 mg·kg- 1)组和hsBAFF (1 mg·kg-1)+ human IgG(2 mg·kg- 1)组.采用MTT、ELISA及流式细胞检测,分别考察各组小鼠脾脏指数、脾脏B淋巴细胞增殖活性及成熟分化和血浆中抗体水平.结果表明:通过注射scFv-Fc有效抑制了hsBAFF引起的脾脏B细胞增殖以及血浆中抗体水平的升高;同时scFv-Fc也显著抑制了hsBAFF引发的B细胞成熟分化,具有潜在的抗体药物开发价值.
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噬菌体抗体库技术研究进展
噬菌体展示技术(PDT)在模拟表位的筛选、筛选特定靶分子的配体、蛋白与蛋白间相互作用、细胞信号转导等基础研究,疾病的治疗和致病机理研究以及疫苗的制备、基因工程抗体的研发等领域均有广泛应用.
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治疗性单克隆抗体研究进展及临床应用现状
19世纪末,动物来源的抗血清用于肺炎、白喉、麻疹等传染病的早期治疗,显示了一定效果,但毒副作用大,特别是异源蛋白易产生过敏反应.1975年杂交瘤技术问世,开创了抗体技术的新时代.单克隆抗体(以下称单抗)高度的特异性和均一性使其在实验研究和临床检测中得到了广泛应用.自1982年单抗首次应用于人体治疗以来,应用单抗治疗肿瘤、自身免疫疾病,组织器官移植排斥反应等疾病的报道渐多,同时鼠单抗用于人体的毒副作用也越来越明显,使单抗在人体治疗中的应用受到很大限制.随着分子生物学技术的发展,尤其是抗体库技术、鼠抗体人源化改造技术以及近年利用转基因技术研制完全人抗体的突破,为单抗进入临床治疗提供了良好的应用前景.本文就单克隆抗体人源化改造、抗体库技术、转基因小鼠技术研究进展及目前单抗在临床治疗中的应用现状予以综述.
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人源性抗bFGF抗体抑制人黑色素瘤生长的作用研究
目的 研究人源性抗bFGF抗体对人黑色素瘤A375细胞的体内外增殖抑制作用.方法 体外培养人黑色素瘤A375细胞,CCK-8法检测人源性抗bFGF抗体对A375细胞增殖的影响；Western blot检测人源性抗bFGF抗体对bFGF下游信号通路中ERK1/2磷酸化的影响；建立裸鼠皮下移植瘤模型,通过记录各处理组裸鼠皮下移植瘤的体积、质量及裸鼠体质量变化,研究人源性抗bFGF抗体在体内对人黑色素瘤生长的抑制作用；免疫组化检测肿瘤组织内的微血管密度.结果 CCK-8实验结果表明人源性抗bFGF抗体能抑制A375细胞的生长,在800 ng/ml的质量浓度下,抑制率为24％；Western blot结果表明人源性抗bFGF抗体显著抑制FGFR下游信号通路中ERK1/2的磷酸化;裸鼠体内试验中,人源性抗体明显抑制了肿瘤的生长,抑制率为28.12％.免疫组化结果显示各组肿瘤组织中微血管密度均有下降.结论 该株人源性抗体在体外可有效的抑制人黑色素瘤细胞的生长,并能在体内抑制肿瘤生长及血管新生.
关键词： 黑色素瘤 碱性成纤维细胞生长因子 人源性抗体 -
肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选
目的探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性.方法从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA,经逆转录-聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因,以pcomb3H为载体,构建噬菌体抗体库,以2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行6轮亲和筛选,再以人成纤维细胞进行2轮吸附,以筛选出抗肺癌细胞抗体.以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性.结果构建成噬菌体抗体库,库容为7.5×107个克隆,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为100%(10/10)和90%(9/10).通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗.结论从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的.
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全国临床肿瘤治疗新技术研讨会
全军肿瘤专业委员会、广东省细胞培养与细胞工程研究会和第一军医大学珠江医院全军肿瘤诊治中心将于2001年10月9～11日联合主办全国临床肿瘤治疗新技术研讨会，会议期间将同时举办全军肿瘤治疗新进展学习班，会议将邀请国内外著名专家报告当今临床肿瘤治疗的新技术和进展，并现场演示临床肿瘤治疗成果。 专题讲座内容包括： 1．乳腺癌治疗策略；2．小细胞食管癌治疗进展；3．人源性抗体与肿瘤生物导向治疗；4．端粒酶抑制剂在肿瘤治疗中的应用前景；5．小移植在实体瘤治疗的进展；6．胃肠肿瘤总体治疗的概念和原则；7．介入治疗实体瘤治疗的进展；8．氩氦靶向治疗技术的进展；9．肿瘤热疗进展；10．组织间植入放疗治疗的进展；11．激光靶向治疗技术的进展；12．基因治疗的进展；13．免疫治疗的进展；14．射频治疗技术；15．立体定向伽玛射线治疗技术；16．超生聚焦治疗技术；17．全身热治疗技术；18．立体适型放疗技术；19．脑立体定向自动导航肿瘤治疗技术；20．肿瘤病人的心理治疗。 会议征文： 会议论文以中文形式投稿，录取论文将收入全国临床肿瘤治疗新技术研讨会论文汇编，评选出的优秀论文将推荐在“IJMCT”杂志(英文版，刊号ISSN1028-1479)发表。 征文内容包括肿瘤诊断治疗的临床进展，新技术的临床应用，评价，经验交流及相关基础研究进展。 会议征文要求： 中文摘要：限800字以内(包括题目、目的、方法、结果、结论。80元／每篇)。参加优秀论文评选者要求提交中文全文，限1*!500～3*!000字以内，包括题目、摘要、方法、结果、讨论。150元／篇)。交寄论文请提供电脑磁盘(word格式)或通过E-mail递交。截稿日期：2001年9月10日。 来稿请寄广州市工业大道中253号珠江医院肿瘤中心(邮编：510282)。联系电话：020-85143484；传真：020-85143479；E-mail：gzzhjr@public.guangzhou.gd.cn；联系人：孙海、李鹏、温居一。
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人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因在Sp2/0细胞中的初步表达
目的在前期工作的基础上,进一步将人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因转染到鼠骨髓瘤细胞Sp2/0并进行初步表达.方法将含人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因的真核表达载体VκEpSVneo,用脂质体法转染鼠骨髓瘤细胞Sp2/0,用RT-PGR法和免疫组化染色法检测转染及表达结果.结果RT-PCR和免疫组化染色结果表明人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因不仅已成功地转染进Sp2/0细胞,并得到了良好的表达.结论在鼠骨髓瘤细胞Sp2/0中成功表达人源性抗HFRS病毒抗体轻链基因,对抗HFRS病毒抗体人源化的研究具有重要意义.
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人源性抗角蛋白Fab抗体脂质体的制备
目的制备人源性抗角蛋白Feb抗体(HAKFA)脂质体,检测脂质体的体外释放及包裹和游离抗体的活性,探索HAKFA可行的应用途径.方法采用逆相蒸发与钙融合联合法制备HAKFA脂质体,在透射电镜下观察脂质体颗粒的性状及大小,应用紫外分光光度计检测抗体的包封率,ELISA检测包裹前后的抗体活性.结果本方法制备的脂质体呈现圆形、粒径大小较一致,约50～100nm;HAKFA脂质体包封率达到(60.3±12.7)％;HAKFA脂质体呈现缓释特性并且抗体依然保持良好的抗原结合活性.结论逆相蒸发与钙融合法为制备HAKFA脂质体较理想的方法.
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基因工程技术制备的人源性抗Mr 48×103角蛋白抗体Fab片段的纯化与活性鉴定
目的用基因工程技术制备人源性抗角蛋白抗体Fab片段,并对其纯度、抗原结合活性及特异性等进行鉴定. 方法将从半合成噬菌体抗体库中成功地筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的阳性克隆转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,产物经金属鏊合层析纯化,并用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性、SDS-PAGE鉴定纯度和蛋白印迹检测抗角蛋白抗体Fab片段识别的抗原组分. 结果可溶性表达的抗角蛋白抗体Fab片段经金属鏊合层析可有效地纯化,蛋白印迹明确纯化产物为人Fab片段.所纯化的Fab片段在非还原SDS-PAGE中形成Mr 50×103单一条带,在还原SDS-PAGE中可见Mr 23×103,Mr 25×103两条带. ELISA和Western blot证实该片段具备良好的抗原结合活性和抗原特异性. 结论成功表达并鉴定了人源性抗Mr 48×103角蛋白的Fab可溶性片段,为人源性抗角蛋白抗体工程化、进一步研究该抗体的生物活性并提高其临床应用价值奠定了良好的基础.
