M3诊断标准及其三亚型的鉴别

急性髓系白血病中的一个特殊亚型,占成人AML的10%～15%,被FAB协作组定为急性髓细胞白血病M3型.其中位发病年龄约40岁.急性早幼粒细胞白血病曾经是白血病中凶险、容易致死的亚型之一,而现在经临床研究这一疾病大多数情况下已成为可治愈的.

人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点Fab单克隆抗体基因的获得

目的筛选人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因.方法根据HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点的氨基酸序列合成23肽,并以此为固相抗原从HIV-1噬菌体Fab抗体库筛选阳性克隆,并进行鉴定及序列测定.结果获得了1株抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点的人源Fab抗体克隆,具有较高的亲和力、特异性和抑制率,序列测定及分析显示该抗体属IgG Ⅰ亚类,κ型,重、轻链可变区分别属VhⅢ和VκⅢ基因家族.结论成功地获得了人源抗HIV-1 gp120趋化蛋白受体结合位点噬菌体Fab单克隆抗体基因.

人源腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段及其全抗体的研制

目的运用噬菌体表面表达技术,获得基因工程抗腺病毒伴随病毒抗体Fab、IgG.方法从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,逆转录cDNA,聚合酶链反应扩增人IgG Fab轻、重链基因,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库.用纯化的腺病毒伴随病毒为固相抗原筛选抗体Fab段,并在E.coli中进行分泌性表达.通过ELISA和间接免疫荧光试验、筛选和鉴定Fab抗体,并进行序列测定.然后将其重链和轻链基因克隆到全抗体表达载体pAC-L-Fc上,转染昆虫sf-9细胞,利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达,免疫沉淀试验鉴定它的抗蛋白.结果分离到一株Fab克隆AAVs-31,腺病毒伴随病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性,间接免疫荧光试验呈阳性,序列分析结果表明是一新的序列,所获得的基因为人源IgG Fab基因,由Gamma链和Kappa链组成.表达的全抗体ELISA反应、免疫荧光反应和间接免疫荧光试验均为阳性,免疫沉淀试验结果显示它结合病毒颗粒,不结合任一VP1、VP2、VP3单独衣鞘蛋白.结论用噬菌体表面表达技术首次获得了抗腺病毒伴随病毒Ⅱ型单克隆抗体Fab段,并在真核系统中表达了其全抗体,它们识别的可能是衣鞘蛋白组装时形成的表位.

流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

目的获得基因工程抗流感病毒抗体，为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法　从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA，Oligo\|Dt逆转录Cdna，聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因，利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A/Sydeny/5/97(H3N2)为固相抗原筛选抗体Fab段，并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果　分离到两株Fab克隆，IV-2和IV-6，流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性，间接免疫荧光实验呈阳性。它们都具有血凝抑制作用，病毒中和实验显示能使病毒滴度下降30倍和20倍。结论　获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体，为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。

急性粒细胞白血病M3b伴嗜酸粒细胞增多

临床上遇到的白血病,多与国际上公认的FAB分类法相符合,但也有例外.现将1例急性非淋细胞白血病M3b伴嗜酸性粒细胞增多报告如下:

急性早幼粒细胞白血病诊治的回顾及进展

急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种特殊的髓细胞性白血病,在法、美、英(FAB)分型中属M3型,具有独特的细胞形态学和生物学特性.APL的特征性标志是染色体t(15;17)(q22;q21)易位,并形成PML-RARα融合基因.因此,t(15;17)(q22;q21)染色体易位和PML-RARα融合基因可以作为APL的细胞遗传学和分子生物学标记物,对APL的诊断、治疗、监测复发、估计预后以及停药时机的确定均有重要意义[1].

基因工程技术制备抗IL-2蛋白抗体Fab片段及其鉴定方法的建立

目的 利用基因工程技术制备人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab抗体片段,并鉴定其抗原结合活性及特异性.方法 用固相化的IL-2蛋白从人天然噬菌体抗体库中筛选出表达抗IL-2蛋白Fab抗体片段的阳性克隆,酶切及连接反应构建可溶性表达噬菌粒转化至大肠杆菌B121(DE3)pLysS中,IPTG诱导表达,并用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定其抗原结合活性和特异性.结果 成功筛选并表达了抗IL-2蛋白的Fab段抗体,在SDS-PAGE中形成47kD的条带,Western blot证明为抗人Fab段抗体;LISA证实该抗体片段具有良好的抗原特异性和抗原结合活性,与牛血清白蛋白、IL-4无交叉反应.结论 成功表达并鉴定了人源性抗IL-2蛋白的可溶性Fab片段,构建了一种制备基因工程抗体的有效途径,为基因工程抗体在肿瘤免疫治疗方面的临床应用研究奠定了基础.

非竞争性ELISA法测定人源抗HBsAg Fab功能性亲和常数

目的测定完全人源化基因工程抗体HBsAg Fab的亲和常数.方法采用非竞争性ELISA固相法,经确定佳抗原包板浓度、佳抗原包板时间及佳抗原与抗体结合反应时间后,得到了HBsAg与抗体片段抗HBsAg Fab及完整抗体抗HBsAg IgG的抗原抗体结合反应曲线,计算出抗HBsAg Fab及抗HBsAg IgG的亲和常数.结果人源基因工程抗体抗HBsAg Fab的功能性亲和常数在107～108M-1水平,比完整抗HBsAg IgG仅仅小约1个数量级(108～109M-1).结论该基因工程抗体与抗原结合能力较强,为今后开发应用Fab进行生物导向治疗提供了理论基础.

人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究

目的探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法,以期大量获取人源抗HBsAg Fab.方法在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,筛选佳的培养模式及诱导表达条件,后于发酵罐中行补料高密度发酵试验,以确定佳补料模式.结果由摇瓶发酵获得的数据表明,当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点,在25℃下以0.2% arabinose诱导12h条件下Fab的产率佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的大OD600达到55.2,相当于湿菌含量110g/L水平.同时,经证实Fab的抗原结合活性良好.结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础.

重组融合蛋白Fab/IFN-αA的表达及其抗乙型肝炎病毒的作用

IFN-αA是治疗乙型病毒性肝炎有效药物,但由于其临床应用的副作用及持久应答率不超过50%,限制了其疗效的发挥[1].作者通过DNA重组技术和PCR技术将抗乙型肝炎表面抗原抗体片段Fab与IFN-αA在分子水平上进行重组,构建了人抗乙肝表面抗原抗体Fab片段/αΑ-干扰素融合蛋白原核表达载体[2].本实验将筛选出阳性克隆的菌种进行诱导表达,测定表达的重组融合蛋白(Fab/IFN-αA)的IFN-αA活性及抗体Fab活性,并应用HBV DNA转染细胞系(HepG2215细胞系)作模型[3],通过检测Fab/IFN-αA作用后细胞上清液的HBsAg、HBeAg水平的变化,结合细胞存活率来评价其抗HBV作用,并与IFN-αA进行了比较.

Objective. To construct ScFv and Fab from murine anti-gastric cancer monoclonal antibody( mAb)3H11. Methods. At first,3H11 ScFv and Fab were constructed with V genes PCR amplified by degenerate primers for FRI. The bacterial expressed 3H11 Ab fragments showed no antigen binding activity. Then, phage antibody library andrandom mutated library were constructed from 3H1 1 hybridoma cells and panning selection was performed. Again the i-dentification of positive clone was failed. Finally the N-terminal sequences of V regions were resumed to 3H1 1 original sequences by site-directed mutagenesis via PCR. Results. Binding activity to gastric cancer cells was detected only from N-terminal sequence corrected 3H11 ScFv and Fab,though the expression of the Ab fiagments was not affected. Correction of either VL or VH N-terminal se-quences could partially resume the antigen binding activity. Conclusion. Sequence changes of V region N terminal introduced by PCR may seriously affect antigen binding without affecting the expression of antibody.Received for publication Oct. 26,1998.

抗胃癌鼠单抗Fab段在大肠杆菌中的表达

目的:探索强启动子T7在可溶性抗体Fab表达中的作用.方法:利用DNA重组的方法将Fd段及K链基因转移到质粒pT7中,置于T7噬菌体启动子的下游,通过蛋白质印迹法证明pT7- 3G9是否有可溶性Fab的表达.结果:pT7- 3G9有可溶性Fab的表达;pT7- 3G9表达的可溶性Fab比p3G9-L高.结论:强启动子系统可作为可溶性抗体Fab的表达载体,T7启动子在可溶性抗体Fab表达中作用比Lac启动子强.

抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab的构建和表达

目的:构建和表达抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab片段,并测定该抗体片段的生物学活性.方法:采用连续PCR方法构建抗人IL-2Rα抗体Fab克隆载体5G1-pA22,并通过限制性酶切反应将抗人IL-2Rα抗体Fab基因从克隆载体5G1-pA22重组入表达载体pET-28b,并在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导以包含体形式高效表达,该表达产物约占菌体蛋白20%以上.经超声破碎、洗涤、变性和复性后,采用双抗体夹心ELISA法及体外抗体竞争抑制试验鉴定表达产物的生物学活性.结果:抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab成功构建,并以包含体形式表达,表达产物的产量达1 mg/ml.双抗体夹心ELISA法试验表明抗体Fab段与IL-2Rα有特异的结合能力,体外抗体竞争抑制实验表明Fab段可拮抗IL-2与活化T细胞表面IL-2Rα有特异的结合,抑制T细胞活化,增殖,抑制率达90%以上.结论:成功地构建了抗人IL-2Rα抗体Fab段,并获得高效表达,其具有较好的生物学活性.

抗p185单抗5E12Fab段基因的克隆及表达

目的:克隆抗p185单抗5E12的Fab段基因并在原核细胞进行表达.方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR),以可变区第一骨架区的通用引物从分泌抗p185单抗的杂交瘤细胞系5E12中克隆Fd段和κ链的基因,重组到Fab表达载体中,在大肠杆菌中表达噬菌体抗体和可溶性Fab;根据前导肽序列设计引物,通过PCR介导的定点突变将V区基因氨基端序列恢复为5E12的原始序列;以NIH3T3/erbB-2细胞ELISA法、免疫组化法等进行特异性鉴定.结果:以第一骨架区的通用引物从小鼠杂交瘤细胞5E12中克隆到Fd段和κ链的基因,在大肠杆菌中表达出Fab段抗体但无特异性抗原结合活性,分别将Fd段和κ链V区基因的氨基端序列矫正为亲本单抗的原始序列后,恢复了Fab段的抗原结合活性.单独恢复Fd段可变区氨基端序列可恢复抗原结合活性.但同时恢复κ链后活性却有所下降.结论:成功构建了抗p185小分子抗体Fab并进行功能性表达,为进一步构建抗p185鼠单抗其他小分子抗体及其人源化改造打下基础;进一步证实抗体氨基端序列对抗体活性的重要性,为今后以PCR方法构建小分子抗体的工作提供了有益的借鉴.

胰淀素Fab抗体的筛选及初步鉴定

目的:从人天然Fab噬菌体抗体库中筛选胰淀素(amylin又称为胰岛淀粉样多肽)Fab抗体,测定其特异性及抗原结合活性.方法:以胰淀素为抗原,对抗体库进行5轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选;将从人源噬菌体抗体库中筛选出的阳性克隆,提取其质粒、切除gⅢ、自身环化并转入大肠杆菌中,以IPTG诱导表达可溶性抗体,后用SDS-PAGE鉴定抗体表达情况、ELISA鉴定抗原结合活性和特异性.结果:成功筛选并表达了抗胰淀素的可溶性Fab抗体,经SDS-PAGE蛋白电泳,在相对分子质量约为47 kD处可见一蛋白条带.ELISA和Western blot证实了该Fab片段与胰淀素抗原的结合活性和特异性.结论:利用噬菌体抗体库技术获得了人源性的特异抗胰淀素Fab抗体,为临床进行下一步研究奠定了基础.

302例急性白血病患者骨髓细胞形态学诊断结果分析

急性白血病(AL)分型及亚型的确定与治疗及预后判断有密切关系.目前采用FAB(骨髓细胞形态学)和WHO两种分型方法.收集302例在我院就诊急性白血病初诊病人,用两种不同方法对比,旨在探讨骨髓细胞形态学与临床诊断的关联性.

仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库的构建及初步筛选

目的 构建仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,并进行初步筛选.方法 用仙台病毒Tianjin株免疫小鼠,制备脾细胞悬液,提取小鼠脾细胞总RNA,RT-PCR扩增鼠抗体轻链(κ链)和重链Fd基因,将轻链基因和噬菌粒p3MH经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后纯化回收,经T4 DNA连接酶连接,电转化E.coli XL1-Blue,构建轻链库；将重链Fd段基因和轻链库p3MH-κ经Spe Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后,纯化回收并连接,电转化E.coli XL1-Blue,获得噬菌体抗体库,计算重组率和抗体库滴度.以仙台病毒Tianjin株重组蛋白HN2为抗原进行初步筛选,制备噬菌体抗体,并进行测序.结果 构建的免疫噬菌体抗体库库容为1.18×107,重组率为90％,制备的噬菌体抗体滴度为1011 pfu/ml；经初步筛选,噬菌体富集了约63.6倍,获得2株与重组蛋白HN2有结合活性的阳性克隆,经NCBIBLAST进行同源性分析,显示为鼠源性抗体,经IMGT分析,显示轻链基因与VK9亚群基因的同源性为94.87％,重链基因与VH7亚群基因的同源性为97.85％.结论 成功构建了仙台病毒Tianjin株噬菌体Fab抗体库,为该病毒株的诊断、疾病治疗及致病机制等研究奠定了基础.

基因工程技术制备人源抗HBsAg抗体Fab片段

将从抗体文库中筛选出的抗HBsAg-Fab阳性克隆转化大肠肝杆菌,IPTG诱导表达,经Western-blot鉴定,证实上清中含有可溶性抗HBsAg-Fab片段,应用自制的羊抗人免疫球蛋白片段抗体(anti-Fab)与Gama-bind交联制备的亲和层析柱纯化表达产物,所得纯化产物在SDS-PAGE中形成单一条带,经Western-blot证实具备良好抗原特异性,Dot-blot证实具备良好抗原结合活性.

MDM2mRNA 过度表达与儿童急性淋巴细胞白血病免疫分型、FAB 分型及高白细胞的关系

为了研究癌基因MDM2mRNA过度表达与儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的免疫分型、FAB分型及临床高白细胞性的关系,用RT-PCR法检测了32例急性淋巴细胞白血病患儿外周血单个核细胞内MDM2mRNA表达水平,并分析MDM2mRNA过度表达与不同型别的关系.高白细胞性白血病(HAL)MDM2表达明显高于非高白细胞性白血病(NHAL)组(P＝0.0099);T淋巴细胞白血病(T-ALL)与非T淋巴细胞白血病(Non-T-ALL)间(P＝0.7345),L1型急性淋巴细胞白血病与L2型间(P＝0.8923)的MDM2mRNA表达水平无差异.提示MDM2mRNA过度表达与儿童急性淋巴细胞白血病的高白细胞性相关.

抗膀胱癌单抗Fab段基因的克隆及表达

目的:克隆抗膀胱癌单抗BDI的Fab段基因并在大肠杆菌中表达.方法:用逆转录-聚合酶链反应技术(RT PCR),从分泌抗人膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆K链和Fd段基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌表达噬菌体抗体和可溶Fab;运用PCR介导的定位点突变改造VH氨基端序列;用ELISA、免疫组化法等进行特异性鉴定.结果:从分泌抗膀胱癌的鼠单抗杂交瘤细胞系中克隆了重链Fd段和κ链基因,在大肠杆菌中获得有抗原结合活性的噬菌体抗体和可溶性Fab的表达,但活性很弱,将VH氨基端序列矫正为亲本单抗原始序列后,明显改善了其活性,通过ELISA、免疫组化及模拟抗体库筛选证实了所获抗体片段的特异性结合及在抗体库技术中的可用性.结论:获得了功能性抗膀胱癌小分子抗体,并再次提示抗体氨基端序列对抗体活性的影响的重要性.