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丹参转录因子SmWRKY1蛋白的表达和纯化条件优化研究
WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白,是植物所特有的转录因子家族.该研究将已克隆的SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约36 kDa,与预测的蛋白相对分子质量一样,说明该基因在大肠杆菌中成功表达.对影响蛋白表达的4个因素:诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化,结果表明在大肠杆菌BL21(DE3)中,当A600达到约1.0 ～1.5时,加入0.2 mol·L-1的IPTG,在20℃诱导培养12h后SmWRKY1蛋白的表达量较高.原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在,采用尿素提取包涵体蛋白,用Ni2+亲和色谱法纯化表达蛋白,纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L-1.经蛋白质印迹检测,His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白,进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达.本研究为进一步开展SmWRKYI基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础.
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融合基因CPA-LTB在大肠埃希菌中表达条件的优化
目的 在构建含有CPA-LTB融合基因的重组菌株基础上,对其表达条件进行优化,以获得高效表达的CPA-LTB融合蛋白. 方法 采用限制性内切酶酶切鉴定含CPA-LTB融合基因的重组质粒pCPA LTB,然后采用均匀设计法对影响目的蛋白表达的因素和水平进行优化:设计实验方案,分别以不同浓度的IPTG和乳糖为诱导剂诱导融合蛋白的表达,SDS PAGE检测不同条件下融合蛋白的表达情况. 结果 双酶切鉴定重组质粒含有CPA-LTB融合基因(1700 bp),且阅读框架正确.以IPTG为诱导剂在pH7.5、诱导温度31℃、转化菌菌液A600值为1.2、IPTG终浓度0.4mmol/L诱导6h,目的蛋白表达量大,占菌体总蛋白相对含量的54％;以乳糖为诱导剂在pH 6.5、温度34℃、转化菌菌液A600值为0.6、乳糖终浓度0.1 mmol/L诱导6h,融合蛋白的表达量大,占菌体总蛋白相对含量的61％.优化前后两种诱导剂诱导表达的蛋白量分别增加63％和42％. 结论 CPA-LTB融合基因表达质粒转化大肠埃希菌在优化的表达条件下高效表达目的蛋白,为研制α毒素基因工程亚单位疫苗奠定了基础.
关键词： 产气荚膜梭菌α毒素 不耐热肠毒素B亚单位 基因融合 基因表达 优化表达 -
人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究
目的探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法,以期大量获取人源抗HBsAg Fab.方法在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,筛选佳的培养模式及诱导表达条件,后于发酵罐中行补料高密度发酵试验,以确定佳补料模式.结果由摇瓶发酵获得的数据表明,当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点,在25℃下以0.2% arabinose诱导12h条件下Fab的产率佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的大OD600达到55.2,相当于湿菌含量110g/L水平.同时,经证实Fab的抗原结合活性良好.结论确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础.
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丹参柯巴基焦磷酸合酶基因的优化表达、纯化及抗体制备
用含丹参柯巴基焦磷酸合酶(Salvia miltiorrhiza copalyl diphosphate synthase, SmCPS)基因的重组质粒pET32CPS转化大肠杆菌BL21trxB(DE3)进行诱导表达,SDS-PAGE结果表明SmCPS基因在大肠杆菌中获得了表达;对影响可溶性表达的4个因素,即诱导温度、IPTG诱导浓度、诱导时宿主菌的密度(A600)和诱导时间进行了优化.结果发现在宿主菌A600达到1.0时加入0.4mmol·L-1 IPTG,在20℃诱导培养8h表达的可溶性蛋白量高,约占细胞总蛋白的35.6%.用Ni2+亲和色谱法纯化表达产物,纯化蛋白产率达到12.3mg·L-1.将纯化蛋白免疫制备兔源SmCPS抗血清,ELISA测定效价为1:24300,且经Western blotting鉴定该抗体可特异性识别SmCPS抗原,获得了效价高、免疫反应性好的SmCPS多克隆抗体,为进一步从蛋白水平研究SmCPS表达与丹参酮类有效成分生物合成相关性提供了物质基础.
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幽门螺杆菌尿素酶B在乳酸乳球菌中表达与优化
目的 探讨幽门螺杆菌尿素酶B(UreB)在食品级乳酸乳球菌NZ3900菌株中的优化表达条件.方法 利用基因重组技术构建乳酸乳球菌NZ3900( pNZ81 10/ureB)；采用L25(56)正交表设计,选定诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间3个因素各5个水平；采用乳酸链球菌素诱导表达后,检测不同组合的UreB在乳酸乳球菌中的表达,凝胶扫描后用Genetools分析软件进行目的蛋白占细菌总蛋白比例分析；应用极差分析法比较影响蛋白表达的因素主次关系及目的蛋白优化表达条件；应用正交试验方差分析法进行方差分析.结果 乳酸乳球菌重组子NZ3900( pNZ8110/ureB)表达的可溶性UreB蛋白高可达27.26 μg/mL,占上清总蛋白比例高可达20.19%；3个因素对UreB蛋白表达量的影响大小依次为诱导时间、诱导时机和诱导剂浓度,方差分析结果显示,诱导时间对UreB蛋白表达的影响具有统计学意义(P＜0.05).结论 应用正交试验法获得UreB蛋白在乳酸乳球菌中的优化表达条件,为进一步评价免疫预防抗幽门螺杆菌感染的效果奠定基础.
关键词： 幽门螺杆菌 乳酸菌 乳酸链球菌肽翻译融合表达系统(NICE) 尿素酶B 优化表达 -
人白细胞介素4在大肠杆菌中的优化表达
目的:通过优化设计利用大肠杆菌表达人白细胞介素4(IL-4)并提高其表达量.方法:根据原核翻译起始序列的局部二级结构自由能,设计了AUG上下游序列,并在人IL-4基因下游插入部分大肠杆菌LacZ序列以提高mRNA的稳定性.结果:成功地构建了人IL-4的高效表达克隆,命名为pLCM182-hIL4.SDS-PAGE分析显示所表达的重组IL-4蛋白质占细菌总蛋白的30%.目的基因下游没有插入LacZ序列所构建的表达克隆pCZH-hIL4在大肠杆菌中的表达量则占细菌总蛋白的20%左右.结论:所设计的优化表达方法对人IL-4基因的表达是成功的,在细胞因子的工程化表达中,优化设计对基因的表达量至关重要.
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Histatin5可溶性突变体融合蛋白在大肠杆菌中的优化表达
目的 优化表达条件,提高Histatin5突变体融合蛋白(GST-HST5)表达量.方法 比较不同IPTG诱导浓度、不同诱导后培养时间,确定优化表达条件.结果 histatin5 突变体融合蛋白经1mmol/L IPTG,37℃ 诱导6h,表达量高.结论 诱导表达条件对Histatin5突变体融合蛋白表达有较大影响.
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特异性抗肝癌单链抗体的表达及意义
目的 优化表达条件,获取有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体.方法 以ITPG诱导大肠杆菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap Anti-E Tag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性;结果 在培养基中加入0.4 M蔗糖,以IPTG 1 mmol/L于30℃诱导12 h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325 μg/L.纯化的抗肝癌scFv与肝癌组织、肝癌细胞抗原特异性结合,与肝硬化、正常肝组织无阳性结合.结论 成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础.
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基因工程抗体anti-HBsAg Fab原核表达体系大规模培养条件的实验研究
目的探讨含anti-HBsAg Fab/pBAD表达载体的工程化大肠杆菌的大规模培养条件.方法在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律,摸索佳的培养模式及诱导表达条件.后根据摇瓶发酵结果于发酵罐中行补料高密度发酵试验,确定佳补料模式.结果由摇瓶发酵获得的数据表明,以培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点、在25℃条件下以0.2%阿拉伯糖诱导12 h,Fab的得率佳,采用溶氧控制补料模式可使培养体系的大D600达到55.2,相当于湿菌含量110g/L水平;同时,经证实Fab的抗原结合活性良好.结论初步确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺路线,为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础.
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人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达
[目的]提高K5突变体(mK5)在原核系统的单位表达量.[方法]调整可能影响表达的参数:抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度,同时固定其它参数.通过电泳分析,获得mK5在原核系统pET22b-BL21的优表达条件:组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白,SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白;MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞(HRCEC)增殖的影响.[结果]优化后的表达条件为:适细菌培养温度为37℃,佳抗生素浓度为50 μg/mL羧苄青霉素,适pH值为7.0,在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为佳诱导条件,37℃诱导10 h为佳诱导时间;优化条件后inK5纯化蛋白得率为21 mg/L,产量较优化前(15 mg/L)提高近30%;inK5特异性地抑制HRCEC的增殖,IC50=40 nmol/L.[结论]本研究确定了mK5蛋白诱导表达的适参数,并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白.为工业化大规模发酵生产提供了基本参数.
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人mBAFF在原核系统的可溶性表达及功能鉴定
目的利用含重组质粒pQE80L-mBAFF的DH5α大肠杆菌,优化表达B细胞活化因子的突变蛋白(mBAFF).方法研究mBAFF的体外诱导条件,包括诱导时间、IPTG浓度、诱导温度对表达量的影响.对表达条件进行优化后进行大量表达,经Ni2+NTA亲和层析和SepharcryL S200凝胶过滤层析纯化.流式检测突变蛋白与细胞结合的能力以及MTT检测突变蛋白的生物学活性.结果佳表达条件是诱导时间4 h,诱导温度37℃,IPTG终浓度0.2 mmol/L.mBAFF占菌体总蛋白的35%,蛋白纯度达98%以上,所获突变蛋白能与淋巴细胞表面受体结合,但不能刺激淋巴细胞增殖.结论优化可溶性表达后能提高mBAFF蛋白质在DH5α大肠杆菌表达,并经Ni+NTA亲和层析和SepharcrylS200凝胶过滤层析得到纯度高的表达产物,所获结果为进一步研究创造了条件.
关键词： B细胞活化因子突变蛋白 优化表达 纯化 -
人源抗-HBs Fab优化表达条件的初步探讨
目的利用含重组质粒pBAD/HBs Fab的Top10大肠杆菌 ,优化表达人源抗-HBs Fab.方法选取含pBAD/HBs Fab载体的Top10大肠杆菌单个克隆分级培养,将制备的二级种子液接种于摇瓶和 KLF2000发酵罐中,摇瓶培养表达采用不同的菌体诱导起始密度、诱导剂浓度、诱导表达温度和诱导表达时间.发酵罐培养表达采用不同的培养基和菌体诱导起始密度.诱导表达完毕后,纯化蛋白,比较表达量,并鉴定所获蛋白的抗原性和生物学活性.结果用摇瓶优化表达后,Fab蛋白占菌体总蛋白的6%,为0.8 mg/g菌体,利用发酵培养可进一步增加菌量,使蛋白表达量达80 mg/ L.所获蛋白经鉴定显示有较好的生物学活性.结论用重组质粒pBAD/HBs Fab,Top10表达系统,可得到80 mg/L的具有较好生物学活性的人源抗-HBs Fab蛋白,为批量生产作了准备.
关键词： 人源抗乙肝表面抗原Fab片段 优化表达 发酵 -
肝靶向干扰素(IFN-CSP)融合基因原核表达条件的优化
本研究目的是优化肝靶向干扰素(IFN-CSP)在大肠杆菌中的诱导表达条件,以提高蛋白表达量.通过考查培养基pH值、诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间和起始菌浓度等五个因素对IFN-CSP融合基因原核表达量的影响,在此基础上,从上述影响因素中各选取4个水平进行正交实验作进一步分析.结果表明,起始菌浓度和诱导温度为影响表达的主要因素,佳组合诱导条件为OD600为0.8时开始诱导、诱导4h、诱导温度37℃、诱导剂IPTG浓度0.4 mmol/L、培养基pH值为6.0,融合蛋白的表达量高达74.3％.通过表达优化后,IFN-CSP的产量为688.8 mg/L,提高了1.2倍.这为进一步制定生产工艺和评价IFN-CSP的生物活性奠定基础.
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小鼠OX40融合蛋白的鉴定、优化表达、纯化及单克隆抗体的制备
目的:鉴定、优化表达并纯化小鼠OX40融合蛋白,制备小鼠OX40单克隆抗体.方法:将已构建好的pET32a-OX40重组质粒DNA转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,涂于含Amp平板筛选出阳性克隆,经Western Blotting鉴定融合蛋白,对阳性克隆株通过分别改变IPTG浓度、培养温度及时间条件,获得佳表达条件,采用包涵体纯化法和SDS-PAGE电泳纯化目的蛋白,免疫BalB/C小鼠,融合、筛选杂交瘤阳性克隆,用间接ELISA及Dot-ELISA鉴定克隆化阳性细胞上清,接种小鼠腹腔体内扩增吸取腹水,经滤膜过滤、饱和硫酸胺沉淀及透析步骤纯化腹水中的抗体,用SDS-PAGE电泳分析纯化抗体.结果:转化的质粒经Western Blotting鉴定,证实有目的蛋白表达.改变诱导条件后SDS-PAGE结果表明,在IPTG浓度0.4mM,温度30℃,诱导4h后,融合蛋白的表达量高,采用包涵体纯化法和SDS-PAGE电泳获得纯化目的蛋白,免疫小鼠后成功制备小鼠OX40单克隆抗体.结论:小鼠OX40融合蛋白在BL-21细胞获得成功表达,同时获得其佳表达条件并成功纯化目的蛋白,成功制备小鼠OX40单克隆抗体.
