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不同条件下连作杭白菊内生菌群的T-RFLP分析
通过研究轮作以及有机肥处理对连作杭白菊各器官内生细菌多样性和优势菌属的影响,揭示轮作和有机肥在缓解杭白菊连作障碍中的作用,筛选能够增强连作白菊抗病能力的有益内生菌.实验共设4个处理组,分别为连作处理、轮作处理、连作后施自制蚕沙发酵有机肥处理以及连作后施市售菌肥处理,通过基于16S rDNA的末端标记限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析这些处理对杭白菊各器官内生细菌多样性及优势菌属的影响.结果显示,HaeⅢ内切酶能产生更多的TRFs数,比HinfI酶更适合用来分析杭白菊内生菌多样性.有机肥和菌肥处理组的内生菌Simpson指数与轮作组相近,均高于连作,说明土壤外源微生物的添加导致植物内生菌多样性提高.实验共筛选出18种优势菌属,包括3种厚壁菌、4种放线菌和11种变形菌,其中节杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属和分支杆菌属等优势菌属均在轮作组和菌肥组中检测到,而连作组中缺乏,说明添加外源微生物与轮作处理对杭白菊的内生菌群的影响基本类似,同时也说明这些菌的增加可能会通过影响连作白术的生长来缓解连作障碍.此外,比较不同器官中的内生菌的多样性及优势菌数量发现,根中高,茎次之,叶中少,这与内生菌侵入植株方式有关.总之,连作导致杭白菊内生细菌多样性降低,而轮作和菌肥处理后均能通过增加土壤微生物的多样性水平从而使连作杭白菊内生细菌多样性提高,终达到缓解白菊连作障碍的目的.
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结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化
研究采用不依赖培养方法T-RFLP,比较结香和非结香的自木香内生细菌的群落结构及变化,研究发现结香后内生细菌的T-RFs、香农多样性指数有增加的趋势,各样品间差异的T-RFs片段数占总T-RFs片段数60％以上,说明结香前后白木香内生细菌的种类发生显著变化.在非结香样品中,内生细菌的优势菌群是Anoxybacillus,Clostridiu,Candidatus endobugula,Lysinibacillus,结香样品中内生细菌的优势菌群为Clostridium,Lysinibacillus,Luteimonas,phytoplasma.另外,在结香和非结香样品中都出现一些特异的T-RFs片段,这些明显的变化使得样品聚类分析时,结香样品内生细菌群落结构相似性比较高聚在一起,非结香样品聚在一起,说明结香前后白木香内生细菌发生显著的、有规律的变化.研究旨在利用不依赖培养的方法首次探讨白木香内生细菌的群落结构及结香中的变化,为合理利用白木香内生细菌资源提供科学依据.
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DETs缓冲液对肠道微生物DNA的保存效果
方便高效的保存方法是开展动物肠道微生物研究的重要前提,用T-RFLP(末端限制性片段长度多态性)结合16S rDNA分析评估了野外采样常用的DETs(20%DMSO,0.25 M sodium-EDTA,100 mM Tris,pH 7.5,and NaCl to saturation)缓冲液对不同保存时间(24h,7天,30天,90天)粪便样品肠道微生物DNA的保存效果.结果表明,DETs保存在30天保存时间内微生物群落结构无显著变化,95.6%的T-RFs仍然存在,能效好的保护肠道微生物DNA.
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蚕沙发酵有机肥对连作杭白菊根际细菌群落的影响
[目的]在杭白菊连作3年的土壤上采用小区实验方法施用蚕沙发酵有机肥，探讨施用蚕沙发酵有机肥对连作杭白菊根际土壤细菌群落的影响。[方法]田间实验设置3个处理组，依次为轮作组（杭白菊与玉米进行轮作），连作组（杭白菊连作3年)，施肥组（在杭白菊连作田，第3年种植初期每株施用蚕沙发酵有机肥15 g）。在收获期进行采样，用HaeⅢ、HinfⅠ分别进行酶切后，采用末端限制性片段长度多样性（T－RFLP）检测。[结果]连作组、轮作组和施肥组的HaeⅢ酶切后Shannon指数分别为：3．08、3．24、3．24，HinfⅠ酶切后Shannon指数分别为3．31、3．60、3．57，可见连作组的细菌多样性明显低于轮作组和施肥组，说明连作使杭白菊根际细菌生物多样性下降，而轮作和施肥则可显著提高根际细菌多样性水平。对优势菌属进行比对分析发现，不同处理组间有较大的差异。连作组的9种优势菌属中梭酸属（Clostridium ）、植原体属（Phytoplasma）、黄单胞菌属（Xan－thomonas）为致病菌属；施肥组的8种优势菌属中梭酸属和黄单胞菌属为致病菌属，另6种为有益菌；轮作组的8种优势属中仅有梭酸属为致病属，其余7种均为有益菌。由此推测，施肥和轮作处理均会改变根际细菌群落结构，主要体现在减少致病菌的伤害。此外，在施肥组中还发现有被誉为生防菌的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。[结论]施用蚕沙发酵有机肥，能有效提高连作杭白菊的根际土壤细菌多样性水平，降低病原菌优势，促进功能菌和有益菌的生长，通过改善微生态环境缓解连作障碍。
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纯胆固醇结石终端限制性片段长度多态性分析
终端限制性片段长度多态性(T-RFLP)以分子生物学的手段,以微生物自身组成成分中的"家族特异性保守物质"的分子进化史等为主要工作对象来研究微生物的群落生态[1].
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胆固醇结石患者胆囊细菌的T-RFLP研究
目的应用T-RFLP分析胆固醇结石中微生物群落结构。方法应用末端标记限制性片段长度多态性（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）和克隆文库分析，以微生物群落16S rRNA基因（16S rDNA）为目标，对8例常规细菌培养阴性的纯胆固醇患者胆囊结石和胆汁中的微生物群落结构进行解析和比较。结果发现8例纯胆固醇结石患者胆汁中未找到细菌存在的证据，结石中细菌16S rDNA阳性率为37.5%（3/8），细菌16S rDNA片段测序表明细菌群落与肠杆菌科和微球菌科的微生物有较高的相似性，同时细菌群落中检出了大量的未培养微生物（Uncultured bacterium clone）。结论运用T-RFLP方法分析16S rDNA克隆片段能够有效评估纯胆固醇结石中的细菌群落结构的多样性。
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拭子提取黏膜部细菌DNA方法的优化
目的:探索一种适合于黏膜部微生物组学分析的DNA抽提方法.方法:评价玻璃珠机械破碎法+溶菌酶裂解法结合DNA提取试剂盒法(Beads+ Lysozyme+ QIA法)和溶菌酶裂解法结合DNA提取试剂盒法(Lysozyme+ QIA法)对9例鼻咽拭子和5株常见细菌的DNA提取效果.利用NanoDrop 2000测定DNA的浓度;以末端限制性片段长度多样性(T-RFLP)分析DNA的生态结构多态性.结果:两种方法对鼻咽拭子总DNA提取量无明显差别(P=0.288);T-RFLP结果显示,Beads+Lysozyme+ QIA法可得到92种末段限制性片段(T-RF),高于Lysozyme+ QIA法所得的43种,Beads+ Lysozyme+ QIA法SDI为(2.34±0.43)明显高于Lysozyme+ QIA法(1.61±1.09)(P=0.03),Beads+ Lysozyme+ QIA法可以获得更丰富的T-RF;Beads+ Lysozyme+ QIA法在表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌中可获得更高的DNA提取量(均P＜0.05),在甲型溶血性链球菌和枯草芽孢杆菌中两种方法无明显差异(P＞0.05).结论:优化的拭子提取细菌DNA的方法可以更大程度地反映样本中微生物的多样性,减少偏倚;有利于黏膜部微生物组学的研究.
