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虫草属基因组DNA提取方法改良研究
虫草属是经过菌感染昆虫后形成的一大类昆虫病原真菌,有冬虫夏草、蛹虫草、亚香棒虫草、半翅目虫草、大团囊虫草、镰刀状虫草、凉山虫草等.其中,冬虫夏草是高级滋补名贵中药材,所含的腺苷等活性成分含量高,而其他虫草并不全具有保健效用.由于虫草属的各科虫草外形相似,冬虫夏草的野生资源匮乏,人工及混杂品充斥市场,因此,虫草属各科的鉴定与分离工作具有一定的难度[1-2].目前,生药学鉴定结合化学分析的方法较为普遍,以生物基因组DNA序列多样性为基础,研究不同物种间遗传差异的DNA指纹图谱鉴定方法也有开展[3].而虫草属各科物种生长周期长、生长速度缓慢,造成虫草属组DNA提取时纯度受限,容易残留蛋白质、次生代谢物、色素等,干扰检测.我们采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法为基础,针对虫草属组DNA的特殊物质进行改进,建立了特异性强、稳定性好、鉴别可靠性强的虫草属DNA提取检测方法.
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几种食用植物油DNA提取方法效果比较
本文主要研究高效简便的食用植物油DNA提取方法,为食用植物油后续核酸检测实验奠定基础.本次实验选取11份不同原料市售食用植物油为实验样品,进行核酸富集处理,采用CTAB法和三种不同试剂盒法对富集前后样品进行DNA提取,用植物叶绿体tRNA基因扩增结果评估DNA提取效率.后得出,结合核酸富集与CTAB法、DNeasy?Plant试剂盒提取食用油DNA,可应用于后续植物油基因检测和成分鉴定.
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饮用水中大肠埃希菌富集和DNA提取方法优化
目的 建立一种灵敏、可靠、快速对水中大肠埃希菌富集和DNA提取的佳方法组合,以便应用TaqMan探针实时荧光PCR技术进行定量检测.方法 膜过滤洗脱环节,采用3种不同的方法进行富集洗脱,通过平板计数法比较各方法富集洗脱效果;DNA提取环节,采用4种方法进行DNA提取.所得DNA进行实时荧光PCR扩增,定量检测DNA拷贝数,比较各方法的DNA提取效率;并采用优的方法组合,对模拟水样进行膜过滤和DNA提取,考察全过程的回收率和灵敏度.结果 采用加表皮葡萄球菌过滤+漩涡混合器+玻璃棒刮擦洗脱方法(C法),洗脱效率能达到75％～93％;TritonX-100法和磁珠法的线性范围达到6个数量级稀释度(100 ～ 10-5),r2分别为0.998和0.999,然而,TritonX-100法更省时,更简便,经济性更好.采用该优的方法组合,其全过程的回收率为79.7％ ～ 104.0％且灵敏度达到1 cfu/ml.结论 C法+Triton-100法组合可以快速、准确、经济地对饮用水中大肠埃希菌进行富集和DNA提取.
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中药DNA条形码鉴定中的DNA提取方法研究
目的:建立一种直接从药材中提取DNA的方法以满足中药材DNA条形码研究的需要.方法:以麦冬药材为实验对象,对比5种常用植物DNA提取方法,筛选出优方法后,对不同部位入药的10种中药材进行DNA提取,采用琼脂糖凝胶电泳及PCR扩增效果进行检测.结果:改良的CTAB法较适合药材DNA提取,虽然所有样品DNA都出现降解,但基于ITS2序列引物PCR扩增成功率为90％.结论:通过增加药材的预处理、核分离液等步骤,并改良CTAB浓度等措施,CTAB法能够用于上述不同药用部位入药的9种药材DNA提取,可以为中药DNA条形码鉴定中的DNA提取提供参考.
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动物药材DNA提取方法优化和市售药材DNA条形码鉴定研究
目的:对动物药材DNA提取方法进行优化,利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定.方法:基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度(0.025、0.25、0.5 mol· L-1)、是否含NaC1和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响,筛选得到佳裂解液配方;使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定.结果:裂解液配方为1％ SDS、0.03 mol· L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果佳,并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取;利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求,所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种.结论:本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取,为动物药材分子鉴定提供了技术支持.
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中麻黄基因组DNA不同提取方法的比较
目的:比较不同DNA提取方法,选择适于中麻黄基因组的方法.方法:采用改良CTAB,SDS法、试剂盒法提取中麻黄基因组DNA;用琼脂糖凝胶电泳法和紫外分光光度法检测所得总DNA的得率和纯度,并进行ISSR-PCR扩增检测.结果:3种方法均可从新鲜中麻黄中提取出产量较高的基因组DNA,但其中改良CTAB法提取的总DNA纯度高,质量好,扩增产物的电泳条带也较明显；SDS法和试剂盒法提取的总DNA质量差,不适用于下游分子生物学实验.结论:改良十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法为中麻黄基因组DNA提取的佳方法,该方法提取的基因组DNA适用于中麻黄基因组PCR扩增和其他分子生物学研究.
关键词： 中麻黄 DNA提取 十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法 -
开口箭DNA提取方法比较
目的:筛选从开口箭不同类型材料中提取DNA的佳方法.方法:采用十二烷基磺酸钠(SDS)法,改良SDS法,十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法4种方法分别对开口箭的新鲜茎、硅胶干燥茎、烘干茎、新鲜叶片和硅胶干燥叶片这5类材料进行DNA提取.从DNA的完整性、纯度、得率等方面对DNA进行比较,确定开口箭不同材料DNA提取的适方法.结果:采用改良CTAB法提取的硅胶干燥茎和叶片的A260nm/A280nm均在1.8 ～1.9,纯度高,且完整性较高,提取效果较其他方法更佳;其余材料则均有不同程度的污染,新鲜叶片的A260nm/A 280nm普遍很低.结论:从硅胶干燥叶片和茎的开口箭材料中更容易提取出纯度高、完整度好的DNA.改良CTAB法是适合开口箭DNA提取的有效方法,通过改良CTAB法从硅胶干燥叶片和茎的开口箭中更容易提取纯度高、完整度好的基因组DNA.
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五味子总DNA提取方法的比较
目的:建立一套适合从五味子种子中提取高质量DNA的方法,为进一步开展五味子分子鉴定奠定基础.方法:比较SDS法、高盐低pH值法以及改进的CTAB法,运用紫外光谱和电泳分析方法测定所得DNA样品的纯度与浓度.结果:3种方法中CTAB改良法所得DNA纯度高,完整性好,且该方法稳定可靠.结论:CTAB改良法是适合从五味子中提取高质量DNA的方法.
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鹿骨类药材DNA提取方法研究
目的:建立一种简便、实用、高效的鹿骨DNA提取方法,为动物骨类药材真伪鉴别奠定基础.方法:取净制后的梅花鹿骨、马鹿骨、牛骨、狗骨、猪骨样品,经干燥、研磨粉碎后,对脱钙时间(24,48,72h),脱钙温度(4,25,37,56,70℃)及不同提取方法(改良SDS提取法、试剂盒提取法)进行考察,分析比较不同提取方法获得的DNA质量.结果:实验证明,脱钙过程有助于骨细胞的裂解,在较宽泛的脱钙时间及脱钙温度下,均可从骨细胞中获得DNA,但提取量稍有差异.结论:骨粉经0.5mol·L(-1)EDTA脱钙液4℃脱钙24h,加入裂解液后56℃水浴1h,即可从鹿骨(约0.1g)中提取到高质量DNA,用于PCR扩增.
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基于ITS序列鉴别石斛类药材
获得高质量的DNA是中药石斛分子鉴别的关键所在.研究比较DNA提取方法(试剂盒提取、CTAB法),从石斛类药材中提取可用于PCR扩增的基因组DNA,基于ITS序列分析进行药材基原鉴别.结果表明,采用改良CTAB法(大量提取),从22批石斛类药材中富集并提取到基因组DNA,通过克隆测序获得ITS序列,同研究积累的石斛属植物ITS序列资料与Genbank序列数据库进行比对分析,根据序列相似性程度从12批黄草药材中鉴定石斛14种,近似种5种;从10批枫斗中鉴定石斛6种,近似种3种.该方法弥补了传统生药学鉴定方法在石斛类药材鉴别上的局限性,具有一定的应用前景.
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人血细胞DNA无酚提取法
目的 寻找佳的从血液尤其是凝血中提取DNA的方法,减少实验和临床检测血液的用量.方法 静脉抽取30份健康体检者的血样,分别抗凝、不抗凝处理后,用经优化的不需要酶和有机溶剂的抽提程序提取DNA,通过电泳和PCR进行检测.结果 凝血和抗凝血的DNA产量分别是(40.2±8.86)mg DNA/L和(39.1±10.2)mg DNA/L;纯度分别为1.87±0.11和1.92± 0.12.所有样本的DNA分子质量都很高,从两者的DNA样本中能很容易地扩增出t-PA基因的第8内含子区ALU等位基因二态性,因此所提取的DNA是完整可靠的.结论 该方法能快速、简单、有效、无毒地从新鲜血液和凝血中提取DNA,适合于临床检测和分子生物学研究.
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甲醛固定石蜡包埋组织中DNA的三种提取方法比较
为了寻找佳的自普通10% 甲醛固定石蜡包埋组织中提取DNA的方法,取我院2000年手术切除的10% 甲醛固定石蜡包埋的食管癌标本10例,分别以蛋白酶K消化酚氯仿抽提法,蛋白酶K消化氯化钠盐析法和不同pH值下加热提取法提取其DNA,然后进行电泳和PCR扩增分析.结果显示,蛋白酶K消化酚氯仿抽提法,蛋白酶K消化氯化钠盐析法所得DNA产量和质量均高于不同pH值下加热提取法.从而认为蛋白酶K消化氯化钠盐析法简便快捷,不用接触有毒的化学药品,是理想的DNA提纯方法.
关键词： DNA提取 PCR 石蜡包埋组织 10％ 甲醛固定组织 -
正交试验优化实现毛细管中的快速高效DNA提取
目的 利用正交试验优化毛细管DNA提取的实验条件,并对优化后的毛细管DNA提取法进行考察.方法 结合液滴与磁珠控制方法,在聚四氟乙烯毛细管中依次完成进样、DNA结合、洗涤以及洗脱等过程,建立毛细管DNA提取法.对照方法采用传统煮沸裂解法.采用正交试验考察血液乙型肝炎病毒(HBV DNA)提取的实验条件,包括结合时间、洗脱时间与洗脱温度等对DNA提取效果的影响.考察毛细管DNA提取法的DNA提取效果与重现性,分析提取的DNA定量(Ct值)与原始样品浓度的相关性.比较毛细管DNA提取法与对照方法提取DNA定量结果及耗时.结果 正交试验提示毛细管DNA提取法的佳实验条件为磁珠DNA结合时间5 min,洗脱温度60℃,洗脱时间1 min.荧光定量PCR显示,毛细管DNA提取法DNA提取效果较好,回收DNA定量具有良好的重现性,提取的DNA定量与原始样品浓度呈正相关(r=0.9999,P＜0.01).配对t检验显示,毛细管DNA提取法的回收DNA定量显著高于对照方法(t=-4.263,P＜0.001).采用优化的实验条件,整个毛细管DNA提取操作在23min内完成,而对照方法耗时45 min以上.结论 利用正交试验实现了毛细管DNA提取实验参数的优化,建立了一种快速、高效的DNA提取方法.
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应用DNA探针检测石蜡包埋组织中结核杆菌DNA的研究
结核病是严重危害人类健康的传染病,近年来发病呈上升趋势.由于外界理化环境的影响及菌体的变异,传统抗酸染色阳性率大为降低.
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不同组织DNA提取的比较
分子生物学技术应用于病理学不仅能辅助诊断,而且在评估预后及指导治疗方面也具有重要作用.DNA提取是分子病理诊断和相关科研中的关键步骤.提取高质量的DNA除了需要操作者的经验、高质量的试剂盒以外,组织的来源也很重要.对于病理科常用的甲醛固定、石蜡包埋(FFPE)组织来讲,往往不同组织来源的DNA质量存在显著差异,是制约后续分子病理检测的重要因素.本文对比检测了不同组织来源DNA的浓度和质量,并加以总结分析.
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石蜡包埋组织DNA快速提取法在分子病理检测中的应用
随着分子生物学的飞速发展,分子生物学技术已在分子靶向治疗、HPV分型检测、淋巴瘤的诊断等方面发挥了极为重要的作用.分子病理检测的首要步骤就是从石蜡包埋组织中提取DNA,常用的DNA提取方法主要有酚-氯仿法、离心柱法等.酚-氯仿法操作复杂,DNA损失较多,并且对人体有害,不适宜用于临床;离心柱法操作较为简便、能够得到较高质量的DNA,是目前临床分子病理DNA提取的主要手段,但其采用蛋白酶K进行组织消化,耗时过长,常需消化过夜.
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石蜡包埋组织中提取结核杆菌-DNA的比较
20世纪80年代以来,结核病出现疫情回潮现象,卫生部今年公布的我国传染病发病率中,结核病居首位.早期诊断、早期治疗是控制传染源并使其有效治疗的关键.用PCR技术检测临床标本中的结核杆菌,为结核病的诊断提供了快速有效的方法.在实际工作中,我们发现由于某些干扰因素的存在,组织中结核杆菌-DNA的检测仍存在诸多问题[1],模板的有效提取直接影响扩增效率.从实际应用的角度出发,我们选取了4种方法进行结核杆菌-DNA提取的比较,现报道如下.
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人体蠕形螨显微操作分离技术的探讨
目的 建立一种清洗分离人体蠕形螨的方法,为人体蠕形螨超微结构观察和分子生物学研究奠定基础.方法 用自制取螨器从成人面部刮取皮脂,放于载玻片上,用2%餐洗净溶解皮脂,显微镜下分离人体蠕形螨并清洗干净,环境扫描电镜观察.另将纯化螨放入经过改造的冰预冷水晶微型研钵中,冰浴研磨,螨体破碎后进行基因组DNA提取.结果 电镜观察螨体表面清洁,无皮脂杂质.螨体粉碎后,DNA提取成功.琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段长度约23kb.结论 使用该分离技术能得到洁净鲜活不变形的蠕形螨,可满足环境扫描电镜观察及分子生物学研究要求.
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一种非致死提取单头家蝇基因组DNA的简便方法
目的 家蝇是一种广泛分布的重要公共卫生害虫,开展其遗传学、分子生物学的研究为认识和利用家蝇、有效地控制蝇传疾病提供科学依据.遗传学、分子生物学的研究常需要用到DNA样品和聚合酶链反应(PCR),建立一种简单快速的DNA提取方法,为研究工作提供极大的便利.方法 剪取家蝇的双翅或后足置于提取液中,温育1h后获得家蝇基因组DNA的样品；以此基因组DNA为模板,扩增CYP6D1v1基因；测定去翅或去后足的家蝇繁殖能力.结果 基因组DNA成功地从家蝇个体的双翅或后足中提取,此DNA制备液可直接用于PCR扩增；剪除双翅或后足对家蝇个体无致命损伤,不影响家蝇的正常繁殖.结论 该方法快速、简便、有效且样品非致死,提取的DNA可以应用于诸如用PCR法鉴定个体基因型等的后续分析.
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外周血单个核细胞DNA提取方法的研究进展
DNA的提取是分子生物学研究的基础技术,提取的DNA的纯度及结构完整性是进行基因工程各项研究所必需的条件.外周血作为一种常用的临床检测材料,如何从外周血单个核细胞中快速、高效的分离提取基因组DNA,对于临床血液检验与分析非常重要.目前,DNA的抽提方法有很多,如酚-氯仿法、盐析法、离心吸附柱法等人工方法,以及磁珠法等半自动方法及试剂盒法.本文就从外周血血液中提取DNA方法的原理、具体操作步骤及方法评估等给予简要的综述.
