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两株内生细菌在人参体内和根区土壤的消长动态研究
目的：研究内生生防细菌在人参根、茎、叶和根区土壤中的消长动态。方法：采用浓度梯度筛选法获得抗利福平标记菌株，灌根法接种标记菌株，稀释平板法计数标记菌株在人参根、茎、叶和根区土壤的分布情况。结果：通过抗生素诱导培养，终获得了能够耐受120μg·mL-1利福平的标记菌株，其对人参黑斑病菌和人参疫病菌的抑制作用与诱导前未见明显改变。内生菌株ge15和ge25在人参根、茎中的初始菌落数高，随后ge15和ge25在人参根、茎中的菌落数逐渐平稳并维持特定浓度；在人参叶中，两株菌在接种3天后菌落数达到高，后逐渐降低直至趋于平稳；在人参根区土壤，ge15的菌落数往复变化，ge25的菌落数先上升后下降，后菌落数趋于平稳。结论：两株内生菌均能够在人参根茎叶和根区土壤中维持特定菌群浓度，基于上述菌株的生防制剂将有助于人参病害的田间防治。
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川芎内生细菌DGGE分析条件的筛选与优化
目的:针对川芎内生细菌16S rDNA序列进行变性梯度凝胶电泳(DGGE)适宜序列的筛选与电泳条件优化.方法:川芎内生细菌16S rDNA的V3区及V6 ～ V8区分别进行聚合酶链反应(PCR)及巢式PCR以获得各菌种的目标DNA序列.采用DGGE垂直电泳法优化凝胶变性梯度,时间间隔法优化电泳时间,并根据电泳效果对电压和电泳时间组合进行修正.结果:川芎内生细菌16S rDNA V6 ～V8区序列更能有效排除宿主植物DNA的干扰,获得更加丰富的内生细菌DNA序列.针对该区的DGGE佳分析条件为变性剂梯度55％ ～70％ (Gel 6％),电泳温度60℃,电压50 V,电泳时间16h.结论:利用该优化条件能有效分离川芎各内生细菌16S rDNA V6～V8区序列,为川芎内生细菌的群落结构PCR-DGGE分析提供可靠的技术基础,为其他药用植物内生细菌的菌群多样性分析提供参考.
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不同条件下连作杭白菊内生菌群的T-RFLP分析
通过研究轮作以及有机肥处理对连作杭白菊各器官内生细菌多样性和优势菌属的影响,揭示轮作和有机肥在缓解杭白菊连作障碍中的作用,筛选能够增强连作白菊抗病能力的有益内生菌.实验共设4个处理组,分别为连作处理、轮作处理、连作后施自制蚕沙发酵有机肥处理以及连作后施市售菌肥处理,通过基于16S rDNA的末端标记限制性片段长度多态性技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)分析这些处理对杭白菊各器官内生细菌多样性及优势菌属的影响.结果显示,HaeⅢ内切酶能产生更多的TRFs数,比HinfI酶更适合用来分析杭白菊内生菌多样性.有机肥和菌肥处理组的内生菌Simpson指数与轮作组相近,均高于连作,说明土壤外源微生物的添加导致植物内生菌多样性提高.实验共筛选出18种优势菌属,包括3种厚壁菌、4种放线菌和11种变形菌,其中节杆菌属、链霉菌属、黄杆菌属和分支杆菌属等优势菌属均在轮作组和菌肥组中检测到,而连作组中缺乏,说明添加外源微生物与轮作处理对杭白菊的内生菌群的影响基本类似,同时也说明这些菌的增加可能会通过影响连作白术的生长来缓解连作障碍.此外,比较不同器官中的内生菌的多样性及优势菌数量发现,根中高,茎次之,叶中少,这与内生菌侵入植株方式有关.总之,连作导致杭白菊内生细菌多样性降低,而轮作和菌肥处理后均能通过增加土壤微生物的多样性水平从而使连作杭白菊内生细菌多样性提高,终达到缓解白菊连作障碍的目的.
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人参内生细菌NJ13在宿主体内定殖特性及对人参黑斑病的防治效果
为明确人参内生生防细菌N J13在宿主体内的定殖特性,该研究通过抗生素诱导获得了同时对利福平和硫酸链霉素具有稳定抗性的双抗标记菌株NJ13-R,分析了菌株在宿主体内的定殖特性,并研究了NJ13对人参黑斑病的田间防治效果.结果表明,菌株在人参根、茎、叶部均可定殖,而且定殖量与接种浓度呈正相关.菌株可在人参不同部位侵染植株并在体内进行转移,在根部和叶部定殖量表现为先升后降的变化趋势,而在茎部呈先升高后平缓趋势.研究还发现,生防细菌N J13表现出对宿主特定部位具有一定的偏好性,随着时间推移在茎部的定殖量高于其他部位.田间试验证明,生防细菌N J13对人参黑斑病具有较好的防治作用,其中0.76×108cfu· mL-1发酵液防效达75.62％,高于对照药剂0.67 mg·L-150％嘧菌环胺WG的防效(73.06％).
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结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化
研究采用不依赖培养方法T-RFLP,比较结香和非结香的自木香内生细菌的群落结构及变化,研究发现结香后内生细菌的T-RFs、香农多样性指数有增加的趋势,各样品间差异的T-RFs片段数占总T-RFs片段数60％以上,说明结香前后白木香内生细菌的种类发生显著变化.在非结香样品中,内生细菌的优势菌群是Anoxybacillus,Clostridiu,Candidatus endobugula,Lysinibacillus,结香样品中内生细菌的优势菌群为Clostridium,Lysinibacillus,Luteimonas,phytoplasma.另外,在结香和非结香样品中都出现一些特异的T-RFs片段,这些明显的变化使得样品聚类分析时,结香样品内生细菌群落结构相似性比较高聚在一起,非结香样品聚在一起,说明结香前后白木香内生细菌发生显著的、有规律的变化.研究旨在利用不依赖培养的方法首次探讨白木香内生细菌的群落结构及结香中的变化,为合理利用白木香内生细菌资源提供科学依据.
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一株人参内生产吲哚乙酸细菌的筛选及鉴定
研究以人参内生细菌为实验对象,采用Salkowski法筛选具有产吲哚乙酸(IAA)能力的菌株,同时采用Ashby培养基验证其固氮潜能,菌碟法及钼锑抗比色法测定其解磷能力,硅酸盐培养基初筛和火焰分光光度法复筛测定解钾能力,刃天青方法检测产生铁载体能力,α-酮丁酸法测定ACC脱氨酶活性;沙土法测定活性菌株对种子发芽的影响.结果从118株菌株中得到1株具有较高产IAA的菌株JJ5-2,其产IAA能力为10.2 mg·L-1;且具有解磷、解钾、固氮和产生铁载体特性;能显著促进人参种子根的生长;通过形态学、生理生化及16S rRNA基因序列分析鉴定菌株JJ5-2为苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis.
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刺五加内生细菌的分离及其抑菌活性研究
目的:研究药用植物刺五加内生细菌的分布,并对刺五加内生细菌发酵液进行抑菌活性筛选,为创制新药提供参考.方法:选取大肠杆菌等12株试验菌株,采用滤纸片法对刺五加内生细菌次生代谢产物的抑菌活性进行筛选.结果:从刺五加根茎中分离得到了25株内生细菌,其中有8株内生细菌的发酵液对12株试验菌表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的32％;对抑菌效果较好的内生细菌CR10及CR15通过形态特征观察、生理生化特性鉴定及16S rDNA序列同源性分析,刺五加内生细菌CR10及CR15为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).结论:刺五加内生细菌发酵产物具有较好抑菌活性,可作为新资源从中寻找新型抗菌物质.
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东北膜荚黄芪内生真菌的分离及其活性代谢物分析
目的:研究北芪内生真菌及其活性代谢产物,旨在深入开发新资源.方法:采用平板分离法从北芪中分离内生真菌,利用滤纸片法对内生真菌活性代谢物进行抑菌活性测定,以芒柄花素及北芪生药为对照,采用HPLC法对北芪内生真菌活性代谢物进行检测分析,同时对筛选出的目的菌株结合形态特征观察及rDNA ITS序列分析进行菌种鉴定.结果:在所得北芪内生真菌中,有25株内生真菌发酵液对11株试验菌表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的83.33％;HPLC分析表明,1株内生真菌发酵产物与北芪生药样品在相同保留时间内有相应的色谱峰出现,其中菌株HZ13经鉴定为链格孢属菌(Alternaria alternata).结论:北芪内生真菌的发酵液具有较好抑菌活性,其中内生真菌HZ13发酵产生北芪活性成分或类似化合物,这为利用内生菌发酵生产北芪活性成分提供了新思路和途径.
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基于16S rRNA序列研究华重楼植株可培养内生细菌的多样性
目的 分析华重楼Paris polyphylla健株和茎腐病感病植株内生可培养内生细菌的多样性.方法 用牛肉膏蛋白胨培养基分离华重楼茎腐病及健康植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌,采用16 S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增结合DNA测序技术,对分离自华重楼健株及茎腐病植株不同部位的细菌进行初步鉴定.结果 从华重楼的健康植株和感病植株中分离到11属23种细菌.从健株分离到4属11种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到9、10和5种内生细菌.从病株分离得到10属14种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到11、8和3种内生细菌.华重楼健株的根茎部内生细菌量高,达2.999×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为7.32×104 cfu/g,华重楼健株根茎、茎、叶中的芽孢杆菌量高,比例分别为73.3％、67.1％和81.8％.华重楼病株的茎部内生细菌量高,达2.817×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为2.76×104 cfu/g,华重楼病株的根茎、茎、叶部的假单胞菌量高,比例分别为35.6％、50.3％和60.5％.华重楼健株不同部位的多样性指数和均匀度指数均高于病株.结论 华重楼健康植株以芽孢杆菌为优势细菌类群,华重楼茎腐病植株以假单胞菌为优势细菌类群.华重楼健株相比病株具有更为丰富的内生细菌群落多样性.
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基于Illumina MiSeq高通量测序分析黄芪内生细菌多样性
目的 分析黄芪内生细菌群落多样性,为筛选菌种发酵转化黄芪中活性成分的定向炮制工艺研究提供参考依据.方法 应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定黄芪内生细菌的16 S rDNA V3-V4区域序列并进行物种丰度等生物信息分析.结果 获得有效序列40 051条,操作分类单元(OTUs) 967个,测序数量接近于饱和,测序数据量合理.黄芪内生细菌主要分布于Anderseniella属、芽孢杆菌属Bacillus、伯克氏菌属Burkholderia、不动杆菌属Acinetobacter、寡养单胞菌属Stenotrophomonas、海洋芽胞杆菌属Oceanobacillus 6个属.结论 黄芪内生细菌群落多样性较低,Anderseniella属和芽孢杆菌属Bacillus是黄芪内生细菌的优势种群.
关键词： Illumina Miseq 黄芪 内生细菌 高通量测序 多样性 -
内生菌与药用植物活性成分相关性研究进展
从药用植物中提取分离出的内生菌的数量和种类不断增多,内生菌不仅自身能够产生活性成分,而且可以促进药用植物产生活性成分.就近年来药用植物内生菌与活性成分相关性研究进展及存在的问题做一综述.
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白首乌内生细菌分离鉴定及系统发育树分析
目的:对中药白首乌根部的内生细菌进行分离、纯化、鉴定及比对,终确定其种属并构建系统发育树.方法:运用涂布法和平板划线法从中药白首乌的块根中分离、纯化内生细菌,对分离得到的纯菌株进行形态学观察、生理生化鉴定,并结合菌株的16S rRNA基因序列鉴定其种属,再将测序结果与GenBank中的已知序列进行BLAST比对,查找相似性高的菌种进行同源性分析,终通过软件MEGA 7.0构建系统发育树确定菌株的系统分类学地位.结果:首次从中药白首乌的根部分离得到12株内生细菌,其中9株属于芽孢杆菌属(Bacillus),相似性为99％～100％;2株属于假单胞菌属(Pseudomonas),相似性为100％;1株属于沙雷氏菌属(Serratia),相似性为99％,确定优势菌属为芽孢菌属.结论:白首乌根中存在多株内生细菌,其很可能是白首乌内生菌资源的重要组成部分,本研究为白首乌内生菌的资源开发奠定了基础.
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植物内生菌的研究进展
植物内生菌是存在于植物内部与植物密不可分的一类微生物,包括内生真菌和内生细菌两大类.随着研究的不断深入,发现内生菌不仅产生多种有益的生物学作用,如防病、促生、固氮等,还能对寄主植物的生长发育产生不利影响.近年来,植物内生菌已成为我国微生物学领域研究的热点问题之一.本文综述了植物内生真菌和内生细菌的研究概况,以期更好地研究和了解植物内生菌.
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浙贝母中内生菌的多样性及组成分析
[目的]研究浙贝母器官内生菌群,以期探明浙贝母道地性的形成机制,为开发其潜在的内生菌资源提供理论依据.[方法]本实验用PCR-变性凝胶梯度电泳(DGGE)对浙贝母的根、鳞茎、地上茎以及叶中的内生菌多样性和组成进行了检测和分析.[结果] DGGE结果表明,浙贝母不同器官中的内生菌多样性和结构均有差异.根部条带明显比其它器官多,内生细菌多样性指数高(2.69),而且出现不少特异性条带;茎中的细菌多样性为2.44;叶中低,仅2.21.测序结果表明,浙贝母中的内生细菌主要为蓝细菌、根瘤菌、睾丸酮假单胞菌、伯克氏菌属和燕麦噬酸菌,后两种菌均为β-变形菌,该菌的存在可能会对浙贝母的生长产生不利影响,而根瘤菌和丛毛单胞菌则对其生长有利.根部特异性细菌包括蓝细菌(B4)、伯克氏菌属(B23)、根瘤菌(B5、B24)以及3种不可培养细菌(B6-B8).与细菌相比,内生真菌DGGE图谱在不同器官之间的差异更小,大部分为共有条带,只是亮度有差异.当然也有特异条带,如曲霉属(F10)仅在鳞茎中出现.镰孢菌属(F11)以及2种不可培养的真菌(F5、F6)为根部特有.与细菌不同,地上茎中的真菌Shannon指数高(2 82),其次是鳞茎和根,叶低2.53.利用DGGE检测到浙贝母的内生真菌主要为侧齿霉、镰孢霉和曲霉,而利用传统方法还分离到交链孢霉、青霉、拟茎点霉、葡萄孢、卵形孢霉、枝链孢霉、毛壳菌、丝核菌以及束丝菌等属,说明对浙贝母而言,传统方法更适合.[结论]浙贝母不同器官中内生细菌和真菌的多样性及组成均存在差异,但地下鳞茎和地上茎差异较小;真菌的器官差异不如细菌明显.浙贝母内生菌的分布跟其它植物明显不同,其菌群组成主要取决于浙贝母宿主植物本身.不同的内生菌占据不同生态位,执行不同功能,有的对促进浙贝母的生长,而有的则影响生长,其中侧齿霉属值得进一步研究.
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具有抑菌活性的麻花秦艽内生细菌的分离鉴定
目的 分离获得的麻花秦艽Gentiana straminea Maxim内生细菌,研究具有抑菌活性的菌株,分析其次级代谢产物.方法 采用平板对峙法,筛选具有抑菌活性的内生细菌;扩增具有抑菌活性菌株的16S rRNA基因,结合形态和生理生化实验,鉴定相应菌株;采用高效液相色谱法(HPLC)对具有抑菌活性菌株的发酵产物进行初步检测.结果 从分离得到的10株内生细菌中,筛选得到2株对沙门氏菌、志贺氏菌和大肠杆菌具有拮抗作用的菌株(Q J3和QJ9).菌株QJ3归属于黄单胞菌属(Xanthomonas),在根、茎、叶、花中均有分布,占总分离内生细菌数量的59.47％,对沙门氏菌具有较强的抑菌作用,抑菌圈直径为15 mm;菌株QJ9为成团泛菌Pantoea agglomerans,仅在茎中分布,占总分离内生细菌数量的0.047％,对志贺氏菌的抑菌能力强,抑菌圈直径为16咖.通过对菌株QJ3和QJ9发酵液检测后发现,两株菌的次级代谢产物中均可能存在龙胆苦苷.结论 麻花秦艽具有丰富的内生细菌资源,在新型抑菌药物筛选的替代资源及活性物质的应用方面具有重要的潜力.
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基于PCR-DGGE技术分析白木香结香前后内生细菌的变化
目的 比较结香与未结香白木香内生细菌群落结构及变化,探讨内生细菌在白木香结香过程中的作用.方法 分别提取结香与未结香白木香总DNA,采用细菌16s rDNA通用引物进行扩增,聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,PCR-DGGE)比较各样品内生细菌群落结构差异,结合样品薄层色谱(TLC)分析,研究活性成分与内生细菌的关联.结果 多食鞘氨醇杆菌Sphingobacterium multivorum在未结香白木香中普遍存在.结香后,内生细菌丰富度和多样性明显增加,PCR-DGGE图谱聚类表明,绝大部分结香样品细菌群态相似性较高,聚在一起;非结香样品间的细菌群态相似性也较高.结论 白木香结香前后内生细菌群落存在明显差异,内生细菌可能参与白木香的结香过程.
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红树内生细菌的分离及皮肤病菌拮抗菌株的筛选
目的 从红树健康植株体分离内生细菌对热带常见致皮肤病真菌进行拮抗菌株筛选.方法 通过表面消毒组织分离法从红树植物秋茄(Kandelia candet)、白骨壤(Auicennia,marina)、无瓣海桑(Sonneratia apetala)的540块组织中分离到内生细菌菌株90株.以致皮肤病真菌须癣毛癣茵(Trichophy menlagrophytes)、白色念珠茵(Candida albicans)、犬小孢子(Microsporum canis)和石膏样小孢子茵(Microsporum gypseum)为指示菌,采用对峙培养法进行筛选.结果 大多数的内生细菌菌株表现一定的拮抗性,对4种病原茵都有拮抗作用的茵株有12株,占总测试菌株的13.33%.其中AC2、SR10、SR17菌株对白色念珠菌(C.albicans)有较强的拮抗作用,而AC2菌株的作用强,抑制率达72.38%,与其他菌株有极显著性差异.AC2初步鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.).结论 从3种红树中共分离获得90株内生细菌.大多数的内细菌菌株表现对致皮肤病真菌一定的拮抗性,以AC2菌株的作用好,具有应用前景.
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苔藓内生菌Bacillus megaterium z12的分离、鉴定和抗菌活性筛选
目的 从无纹紫背苔(Plagiochasma intermedium)叶片中分离筛选出一株具广谱抗菌活性的内生菌z12.方法 根据菌落和细胞形态、生理生化特性,以及16S rDNA序列对内生细菌z12进行了分析鉴定,并研究了它对14种供试菌株的抑制作用.结果 经分析鉴定该菌属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium).抑菌实验表明,内生细菌z12对7种供试菌都有不同程度的抑制作用,对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和白念珠菌(Candida albicans)的抑制作用较强.研究了z12菌株粗提物对水稻纹枯病原菌(Corticium sasakii)的抑制作用.结论 该菌株具有开发成农用抗生素的价值.
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秋茄内生细菌多样性及抑制甘蔗黑穗霉菌活性研究
目的 系统地对广西北海金海湾红树植物秋茄(Kandelia candel)内生细菌的分布特征与物种多样性进行分析,开展细菌代谢粗提物对甘蔗黑穗霉菌的抑制活性研究,为开发新型生物类农药及生物膜制剂奠定基础.方法 采用7种分离培养基,从秋茄各部位组织中分离可培养细菌;通过16S rRNA基因序列的系统发育学分析其物种多样性.采用牛津杯法研究内生细菌对甘蔗黑穗霉菌的抑制效果.阳性菌株通过PCR扩增筛选次级代谢产物生物合成基因PKS Ⅰ、PKS Ⅱ和NRPS.结果 经形态学分析及16S rRNA基因序列对比后,从秋茄各组织部位中分离到50株内生细菌,隶属于21科27属.从秋茄叶子中分离到BGMRC2075菌株与已有细菌物种典型菌株的全长16S rRNA基因相似性为96.12％,提示其为潜在新种.37株细菌对甘蔗黑穗霉菌有抑制作用.其中,16株菌可能存在至少1种NRPS、PKS Ⅰ和PKS Ⅱ生物合成基因簇.结论 秋茄中可培养细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着潜在新物种资源,且富含抑菌活性的菌株.
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滇重楼内生细菌分离及抑制人体病原菌活性菌株筛选
目的 分离滇重楼内生细菌,研究其抑制人体病原菌的能力.方法 从表面消毒的滇重楼新鲜植株中分离内生细菌.在体外,用提取物抑制金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌及白色念珠菌生长.结果 来自温室的植株分离到更多的内生细菌,植株地下部位中内生细菌比地上部位更多;约60%内生细菌对指示菌有一定抑制作用,其中LRB11抑菌效果较明显.结论 由于内生细菌与宿主相互作用,故具抑菌作用的内生细菌可用于新药的开发或中药植物的生防.
