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云南省德宏州居住区啮齿动物携带巴尔通体的调查研究
目的 调查云南省德宏傣族景颇族自治州(德宏州)居住区啮齿动物的巴尔通体感染和分布特点,为相关疾病防制提供参考依据.方法 采用笼夜法捕鼠,采集鼠类脾脏标本,用胰酶大豆琼脂培养基分离巴尔通体,用聚合酶链式反应法扩增巴尔通体gltA基因片段,并进行核苷酸序列测定和系统发育分析.结果 2011年在德宏州居住区共捕获啮齿动物5属9种340只和食虫动物2种18只,黄胸鼠为优势种(77.09％,276/358).这些动物的脾脏标本中巴尔通体分离率为24.86％(89/358),其中黄胸鼠分离率为28.99％ (80/276),其他阳性鼠种为黑缘齿鼠(5株)、社鼠(1株)、大绒鼠(1株)、小泡灰鼠(1株)和臭鼩鼱(1株).共获得85株巴尔通体gltA基因核苷酸序列,进化分析表明,40株为特利波契巴尔通体(Bartonella tribocorum),28株为伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae),11株为昆州巴尔通体(B.queenslandensis),3株为森林巴尔通体(B.silvatica),3株未定种.黄胸鼠携带上述所有种类的巴尔通体.结论 德宏州啮齿动物中至少存在4种巴尔通体的流行,巴尔通体具有遗传多样性特点.以特利波契巴尔通体、伊丽莎白巴尔通体和昆州巴尔通体为主要流行菌株,黄胸鼠为当地居住区巴尔通体的主要宿主.今后应加强巴尔通体相关疾病的监测和防制工作.
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牡蛎养殖区人群诺如病毒感染监测对暴发的预警作用
目的 了解牡蛎养殖区人群诺如病毒感染病例的流行特征,研究病例监测对暴发的预警作用.方法 2014年1-12月,采用多阶段抽样方法从牡蛎养殖区选取部分社区人群进行入户调查,回顾其过去4周内急性胃肠炎的发病情况.采用实时RT-PCR与半巢式PCR相结合的方法检测诺如病毒,测序并绘制系统发育树.结果 调查共发现75例急性胃肠炎病例,年发病率为0.10次/人年;诺如病毒阳性率为20.0% (15/75);系统发育分析显示,诺如病毒优势流行株为GII.4 Sydney 2012;发现新型GII.17变异株,检出时间为2014年3月.结论 GII.4 Sydney 2012仍是引起当地诺如病毒感染急性胃肠炎的主要流行株,在牡蛎养殖区哨点医院诺如病毒感染病例监测中发现的GII.17变异株对2014年冬季的暴发流行具有早期预警作用.
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2013-2014年湖北省哨点医院A组轮状病毒G和P基因型遗传变异分析
人轮状病毒是引起婴幼儿腹泻常见的病原体之一，轮状病毒广泛分布于世界各地。人轮状病毒分A、B、C三组，其中A群组轮状病毒（rotavirus A，RVA）是引起婴幼儿腹泻主要的病原体，严重影响儿童的健康[1]。轮状病毒于1973年由澳大利亚学者R.F. Bishop发现，归类为呼肠孤病毒科轮状病毒属(rotavirus，RV)[1-2]。其基因组由11个片段组成的双链RNA，分别编码6个结构蛋白(VP1~VP4，VP6， VP7)和5个非结构蛋白(NSP1~NSP5)。按照衣壳蛋白VP6的抗原特异性不同，可将RV分为A、B、C、D、E、F、G等7个组。与人类关系密切的是A组RV，其中VP4和VP7是重要的外壳蛋白，根据VP4和VP7的差异可将A组RV分为P型和G型。目前已发现27个P型和19个G型，常见的型别为G1～G4和P4和P8，而常见G、P组合为G1P[8]， G2P[4]，G3P[8]，G4P[8]和G9P[8][2]。本研究采用2013—2014年间湖北省襄阳、恩施腹泻监测哨点医院收集的腹泻粪便标本进行轮状病毒核酸检测和G、P分型，并分析该地区RV感染的流行病学特点。
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蝉花内生真菌多样性分析及菌株分离鉴定
目的:探讨蝉花内生真菌的多样性,明确蝉花的寄生菌.方法:采用Illumina Miseq对江苏蝉花内生真菌进行多样性分析,采用传统分离培养法对蝉花内生真菌进行纯种分离培养,并用克隆测序对DNA的ITS序列进行测序,通过和NCBI数据库比对确定菌种.结果:Illumina Miseq测序Alpha多样性结果显示,Chao指数为11,Shannon多样性指数为0.313,Simpson多样性指数为0.891;OTU的数量为11个.蝉花内生真菌11个OTU均为蝉棒束孢属(Isaria).通过传统分离培养法,分离得到菌株JS01,通过克隆测序与NCBI比对,结果显示菌种为大蝉草.结论:江苏茅山蝉花内生真菌丰富度较低,多样性较少,蝉花的寄生真菌为大蝉草.
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玄参内生真菌分离、鉴定及系统发育分析
分别从武隆产区玄参根、主茎、侧枝、叶片和重庆市区栽培玄参侧枝中分离内生真菌,根据形态学特征和26SrDNAD1/D2测序结果对其进行鉴定,并进行了种群多样性分析,对优势属炭疽菌属内生真菌构建了系统发育树.试验结果显示:真菌种群多样性指数,武隆玄参叶片>主茎=侧枝>根,重庆玄参侧枝>武隆玄参侧枝.共计分离得到内生真菌58株,绝大部分是各种植物病原菌,其优势属为刺盘孢属Colletotrichum,其中绝大多数是C.gloeosporioides和C.boninense.叶片和子芽可能是内生菌侵染的主要途径;内生菌和病原菌可能相互转化,受环境、基因型等多种因素影响.
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2013～2014年山东省4株柯萨奇B4型分离株遗传分析
尽管柯萨奇病毒B4 (Coxsackievirus B4,CVB4)分离率不高,但是在我国引起儿童脑炎的病例屡屡报道.目前人们对CVB4基因组的遗传变异了解并不多,GenBank公共数据库仅仅存储有20几个CVB4全基因组序列,分离自我国的CVB4基因组序列不足10条.本研究对2013～2014年山东省分离的4株CVB4阳性样本进行高通量测序,测得其全基因组序列,利用Mega 5.1对CVB4型毒株全基因组及VP1片段进行系统发生及同源性分析,用RDP3和SimPlot 3.5.1软件进行基因重组分析.结果显示这4株病毒为柯萨奇病毒B4(Coxsackievirus B4,CVB4)型,全基因组序列长度分别为7 372bp、7 389bp、7 389bp和7 391bp,核苷酸同源性为97.1％～99.9％,氨基酸同源性为98.5％～99.9％.与2013年温州CVB4分离株CVB4/P11/2013/China(GenBank登录号:KP289433)分离株同源性高,核苷酸及氨基酸同源性分别为97.1％～98.3％和98.6％～99.4％.对VP1基因进行系统发育树分析表明,VP1基因可划分成5个基因型,基因型内部序列距离小于15％,而基因型间距离均大于15％.另外,4株CVB4分离株VP1的进化关系较近,同近年来国内其他分离株单成一簇,属于基因型V分支.经RDP3和SimPlot 3.5.1软件分析发现,这四个CVB4分离株均发生了基因重组,分离株SDJN/CHN/2013可能发生了两次基因重组.综上,这4个CVB4分离株基因组高度相似,均位于基因型V分支,且基因组发生了基因重组.
关键词： 柯萨奇病毒B4型(CVB4) 系统发育分析 VP1 基因重组 -
用16S rRNA基因序列分析从西藏的微小牛蜱中检出的埃立克体
用埃立克体属特异性套式PCR和DNA序列测定从西藏微小牛蜱检出边缘无形体和埃立克体;用半套式PCR扩得该埃立克体的16S rRNA基因,并测定了它的序列;将该埃立克体的16S rRNA基因序列与其它埃立克体的16S rRNA基因序列进行对比分析,结果证明它的16S rRNA基因与埃立克体属的犬埃立克体群16S rRNA基因相似水平高(97%～98%);用16S rRNA基因序列做系统发育分析,结果显示该采自西藏的微小牛蜱的埃立克体可能是与查菲埃立克体密切相关的一种新埃立克体.
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宁夏不同栖息环境啮齿动物巴尔通体感染状况调查
目的 调查宁夏地区啮齿动物巴尔通体感染状况,了解当地鼠传巴尔通体物种组成.方法 用夹夜法在宁夏不同地区、不同生境捕获啮齿动物,无菌操作取肝和脾,应用PCR扩增巴尔通体特异性gltA基因鉴定菌株,对阳性标本进一步扩增,ftsZ、rpoB和16S rRNA基因测序并进行序列分析.用Mega 6.06软件进行比对,应用邻接法构建系统发育树.结果 从贺兰山、银川市、中卫市和固原市选择14个采样点,涵盖草原、灌丛、农田和林地4种生境,共采集啮齿动物样品234份,分离培养巴尔通体51株,感染率为21.79％ (51/234).共捕获啮齿动物13属20种,有7属9种啮齿动物分离出巴尔通体.阿拉善黄鼠、黑线姬鼠、大林姬鼠、三趾跳鼠、子午沙鼠、长尾仓鼠、长爪沙鼠、洮州绒鼠和五趾跳鼠的感染率分别为45.45％ (5/11)、33.33％(15/45)、33.33％(11/33)、25.00％ (5/20)、20.83％ (5/24)、17.86％(5/28)、14.29％ (1/7)、13.64％(3/22)和11.11％(1/9),阿拉善黄鼠感染率高.系统发育分析提示分离的巴尔通体与格拉汉姆巴尔通体(Bartonella grahamii)、伊丽莎白巴尔通体(B.elizabethae)、非洲跳鼠巴尔通体(B.jaculi)、日本巴尔通体(B.japonica)和泰勒巴尔通体(B.taylorii)相似度较高.结论 宁夏地区啮齿动物中存在巴尔通体自然感染,在多种鼠类、不同生境中均有分布,且感染率较高;序列分析显示巴尔通体基因型呈多样性,且具有致病菌种,人群暴露在相应环境中与鼠群接触存在感染致病的风险.
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黑龙江省黑瞎子岛地区小型哺乳动物的调查研究
目的 了解黑龙江省黑瞎子岛地区小型哺乳动物的物种多样性及其与其他地区相应物种间的关系,为可能存在于该岛的自然疫源性疾病的病原体筛查工作奠定基础,为疾病的预防与控制提供科学依据.方法 用夹夜法捕捉小型哺乳动物,首先进行形态学鉴定,然后用PCR方法扩增线粒体细胞色素b(mt-cytb)基因并测序,所得序列与GenBank中该物种的不同地区相应序列进行同源性比较和系统发育分析.结果 共捕获374只小型哺乳动物,分属于2目4科6属9种,其中黑线姬鼠和红背鼠平为优势鼠种.形态学和分子生物学方法鉴定结果相一致.结论 黑瞎子岛上小型哺乳动物物种复杂,具有多样性,并且mt-cytb基因未发生明显变异.岛上多个物种可以携带自然疫源性疾病的病原体,因此该研究对当地的疾病预防与控制具有重要的指导意义.
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丙型肝炎的病理生理学及抗病毒治疗
丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒(Flaviviridae)家族中的嗜肝病毒(Hepcivirus).它是一种直径为55～65 nm的单股正链RNA病毒.HCV完整基因组或部分序列的系统发育分析证实,HCV主要存在6种基因型和50多种亚型.不同基因型的核苷酸序列异源性为33％～34％,氨基酸序列异源性约30％,而基因亚型不同区域的核苷酸序列异源性为20％ ～ 23％.人类是HCV惟一的宿主,全球大约1.7亿即3％的人口受HCV感染.HCV从世界的一个区域向另一个区域传染流行.HCV主要经血液传输(医药和手术传输过程、静脉内注射毒品以及输血过程).在发达国家,由于高危途径如输血传播和医院感染已得到了有效的控制,60％～70％的新感染病例与静脉内注射毒品相关[1].
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幽门螺杆菌cagA基因及蛋白序列多态性分析
目的:结合本实验室研究结果,充分利用NCBI的核酸和蛋白数据库中检索到的CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列,分析其序列特征以及与地域和疾病的相关性.方法:利用Vector NTI Suite 9.0,ClastalX(version 1.8),Phylip(version 3.5)和Treeview(version 1.61)软件对检索到的幽门螺杆菌CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列进行多序列比较和系统发育分析.结果:检索到可以利用的全序列44条,部分序列560条.通过44条全序列比对,相似性分析和构建系统进化树,发现CagA基因碱基和蛋白质氨基酸序列可分为具有明显地域特征的东西方两类.通过44条CagA全序列和266条C端部分序列分析,发现C端相对多变区的重复序列可分为两类:第一类为菌株共有的不连续重复序列,第二类为个别菌株特有的连续重复序列,此类重复序列包含EPIYA模体的重复.序列特征与疾病的关系分析表明,非胃癌株中包含第二类重复序列的菌株占13%(9/71),胃癌株中包含第二类重复序列的菌株占3l%(12/39),X2检验P=0.021＜0.05,故可以认为胃癌株中包含第二类重复序列出现率高于非胃癌株,可以认为包含第二类重复序列的菌株与胃癌有关.结论:幽门螺杆菌CagA基因及蛋白序列多态性明显,具有东西方两个地域聚类特征,重复序列可分为两类.第二类重复序列中包含EPIYA模体的重复可能导致菌株致病性增强.
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发热患者血液标本中Rothia aeria的分离鉴定与系统发育分析
目的：总结Rothia aeria血流感染的临床与实验室鉴定特点，为临床诊疗提供帮助。方法复习由该菌引起的血流感染病例，综合其形态学特征、生化特性、MALDI Biotyper质谱和16S rRNA序列相似性和系统发育分析对该菌进行分离培养、鉴定和药敏试验。结果 Rothia aeria血流感染为国内首例（Genbank登录号为KF691779）报道，经质谱和16SrRNA可准确鉴定Rothia aeria。药敏试验结果显示其对左氧氟沙星、青霉素、氨苄西林、红霉素、庆大霉素、亚胺培南、哌拉西林和头孢他啶均敏感。临床根据药敏结果选用氨苄西林舒巴坦足量足疗程治疗，患者好转出院。结论 Rothia aeria引起感染临床少见，16S rRNA和质谱能准确鉴定Rothia aeria，血培养对病原诊断有重要价值。
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侵袭性感染金黄色葡萄球菌的毒力基因系统研究
目的：研究侵袭性感染金黄色葡萄球菌分离株的毒力基因存在状况，为临床治疗提供参考依据。方法收集杭州市余杭区中医院2013年2－7月20株金黄色葡萄球菌侵袭性感染临床分离株，采用聚合酶链反应（PCR）的方法，分析共6大类94种毒力基因；并对毒力基因检测结果作菌株系统发育分析，数据采用SPSS 17．0软件进行统计分析。结果20株侵袭性感染金黄色葡萄球菌中共检测到66种毒力基因：包括11种黏附毒素毒力基因、6种细胞毒素毒力基因、3种侵袭性酶毒力基因、12种超抗原毒力基因、32种外毒素毒力基因、2种荚膜抗原毒力基因；系统发育分析结果为20株金黄色葡萄球菌可分为A、B两个簇群，其中B簇群中的11、14号株和2、3、19号株可能为克隆播散。结论侵袭性感染金黄色葡萄球菌携带多种毒力基因，具有极强的侵袭性和定植能力，对人体致病性强，对金黄色葡萄球菌人体侵袭性感染分离株进行黏附毒素、细胞毒素、侵袭性酶、超抗原、外毒素、荚膜抗原等六大类94种毒力基因检测研究为国内首次。
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蝙蝠蛾拟青霉与冬虫夏草关系的分子系统学研究
以5月和6月两个不同时段采集的分别产于青海省化隆县和四川省康定县的冬虫夏草(Cordyceps sinensis)新鲜子实体为材料,采用分子生物学方法,以rDNA-ITS序列为分子标记,对蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)与冬虫夏草之间的关系进行了探讨.以真菌通用引物ITS1/ITS4分别对蝙蝠蛾拟青霉及冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA进行PCR扩增,获得的片段克隆到pMD18-T Vector上进行测序,结果表明,随机挑取的46个克隆与某些已在GenBank中注册的中国被毛孢(Hirsutella sinensis)或冬虫夏草的rDNA-ITS序列的一致性均在99%以上.但与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列的一致性约为72%.根据蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列设计了两对特异引物,分别以不同产地及不同生长时期共4个批次的冬虫夏草子座和僵虫基因组DNA为模板,进行PCR及巢式PCR扩增,均得到了相应片段,该片段与蝙蝠蛾拟青霉的rDNA-ITS序列具有100%的一致性.在GenBank中注册号为AB067740的另一个标明为冬虫夏草的rDNA-ITS序列与注册号为AJ309353的中国被毛孢的rDNA-ITS序列一致性仅为87.3%,但根据AB067740序列设计特异引物,也从冬虫夏草基因组DNA中扩增到其相应序列.研究结果表明,在天然冬虫夏草中除了中国被毛孢之外,还普遍存在着蝙蝠蛾拟青霉等内寄生菌.
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严重急性呼吸综合征实验室诊断研究进展
严重急性呼吸综合征(SARS)是21世纪首次出现的全新传染病,病情严重,传播力强.世界卫生组织(WHO)于2003年3月12日发布全球疫情警报:3月17日组织9个国家顶级实验室组成多中心合作研究网络,主攻SARS的病原和特异性诊断,4月16日WHO向全世界宣布:SARS的病原是一种人类未曾见过的冠状病毒科成员,命名为SARS相关冠状病毒(SARS-CoV).经测序分析,病毒基因组全长29727个核苷酸,有11个开放阅读框架,基因组结构与其他冠状病毒相似.但系统发育分析和序列比较表明,与已鉴定的有任何冠状病毒无密切关联,是一种新的冠状病毒[1].实验室检测技术包括SARS-CoV病原的检测、SARS-CoV核酸检测、血清学抗体检测等方面[2],为SARS临床诊治提供越来越多的新的有用信息.现将国内外有关这方面的研究进展综述如下.
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白首乌内生细菌分离鉴定及系统发育树分析
目的:对中药白首乌根部的内生细菌进行分离、纯化、鉴定及比对,终确定其种属并构建系统发育树.方法:运用涂布法和平板划线法从中药白首乌的块根中分离、纯化内生细菌,对分离得到的纯菌株进行形态学观察、生理生化鉴定,并结合菌株的16S rRNA基因序列鉴定其种属,再将测序结果与GenBank中的已知序列进行BLAST比对,查找相似性高的菌种进行同源性分析,终通过软件MEGA 7.0构建系统发育树确定菌株的系统分类学地位.结果:首次从中药白首乌的根部分离得到12株内生细菌,其中9株属于芽孢杆菌属(Bacillus),相似性为99％～100％;2株属于假单胞菌属(Pseudomonas),相似性为100％;1株属于沙雷氏菌属(Serratia),相似性为99％,确定优势菌属为芽孢菌属.结论:白首乌根中存在多株内生细菌,其很可能是白首乌内生菌资源的重要组成部分,本研究为白首乌内生菌的资源开发奠定了基础.
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吐尔基山辽代贵族墓葬人骨遗骸线粒体DNA多态性分析
目的:利用分子生物学方法确定吐尔基山辽墓主人的身份及其与契丹贵族的关系.方法:对吐尔基山辽墓出土的人骨遗骸进行mtDNA研究,使用4对套叠引物对线粒体第一高可变区(360 bp)进行扩增和测序,利用契丹贵族人群的相关序列,对所得序列进行分子系统学分析.结果:与剑桥序列进行比对,共有5个突变位点;系统发育分析结果表明,吐尔基辽与契丹贵族人群遗传距离近,且在契丹贵族的2个家族中与耶律羽之家族的亲缘关系相对较近,验证了吐尔基山辽墓主人的贵族身份.此外,与其他已报道人群数据进行比较表明,吐尔基山辽墓主人与现代外蒙古人群遗传距离近,其5个突变位点均为蒙古人的突变热点.结论:吐尔基山辽墓样本应属于北亚蒙古人种.
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内蒙古朱开沟遗址古代居民线粒体DNA分析
目的:探讨内蒙古朱开沟古代居民的遗传关系.方法:对9例保存较好的个体牙齿的线粒体基因组的高可变一区进行扩增和测序,与内蒙古饮牛沟古代人群及现代亚洲人群对比进行系统发育分析,并推测单倍型类群归属.结果:获得7例朱开沟遗址古代居民线粒体基因组高可变一区364 bp的序列,共检测出15个突变位点,界定7种单倍型,并归属到单倍型类群.结论:朱开沟古代居民在母系遗传上与其后的饮牛沟墓地古代居民及现代内蒙古地区人群关系密切,内蒙古中南部地区人群母系遗传结构具有连续性.
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一株纤维素降解菌的分离、鉴定及产酶条件初步研究
目的:筛选具有纤维素降解能力的菌株.方法:在广州近郊自然环境取样,利用CMC固体平板筛选具有纤维素降解能力的茵株.结果:分离获得1株纤维素降解能力较强的菌株OY-01.该菌株适生长温度和pH分别为35℃和6.0-7.0.形态学观察、生理生化和28S rDNA序列分析表明该菌株属于烟曲霉(Aspergillus fumigatus).结论:菌株OY-01被鉴定为烟曲霉,其适产酶条件为:氮源为硫酸铵,浓度0.15%,温度为35℃,初始pH6.0-7.0,培养48-60h,Aspergillus fumigatus OY-01具有一定的工业应用潜力.
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来自同一供者的不同HIV-1感染者体内病毒包膜序列变异性分析
目的 调查同一供体来源HIV-1病毒包膜序列变异情况,为进一步进行表型特征、病毒感染能力以及抗病毒免疫研究奠定基础.方法 从6例同一来源HIV-1感染者外周血单个核细胞中提取DNA,设计跨病毒包膜的保守引物,进行PCR扩增,将扩增产物克隆至质粒载体,筛选阳性克隆进行序列测定.采用生物信息学方法对其进行系统发育特征以及编码氨基酸的变异性进行了分析.结果 共获得6个有完整开放读码框的包膜克隆.在6个克隆中,包膜糖蛋白gp120内变异程度大的区域分别为信号肽区、可变区V1/V2区、恒定区C2区内近V3区部分、V4区和V5区.变异包括点突变、氨基酸插入或缺失等.系统树分析发现所获得病毒克隆与中国分离株BCNB03聚集成一束.结论 构建并鉴定了6个HIV-1包膜克隆.同一来源的HIV包膜糖蛋白在不同受者体内发生了较大变异.
关键词： I型人类免疫缺陷病毒 包膜 变异性 系统发育分析
