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2010年广东省深圳市首例手足口病死亡病例的病原学研究
目的 对广东省深圳市2010年首例临床诊断为手足口病死亡患儿的粪便和咽拭子标本进行病原体型别鉴定,从而追踪其病原的可能来源.方法 先用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)方法检测病毒核酸,再用细胞培养方法从粪便和咽拭子标本中分离病毒,并将分离到的毒株提取核酸后,用普通RT-PCR方法分别扩增肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)的VP1区全长基因并进行序列测定,序列测定结果与不同国家和地区的肠道病毒株A、B、C基因型代表株进行同源性比较和进化树分析.结果 该病例的2份标本均为EV71核酸阳性,Cox A16核酸阴性；毒株基因经过核苷酸和氨基酸同源性分析,确定该病例病原体为EV71 C4亚型.结论 2010年深圳市首例手足口病死亡病例的病原体为EV71的C4亚型.
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2017年辽宁省人感染汉坦病毒G2片段基因序列特征分析
目的 了解2017年辽宁省肾综合征出血热(HFRS)患者感染汉坦病毒的(HV)的基因型别及变异情况.方法 采集HFRS患者急性期血清,采用酶联免疫吸附试验筛选IgM抗体阳性标本,从阳性标本全血中提取HV的RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增G2基因片段并进行基因分型,对扩增产物进行核苷酸序列测定,利用DNAStar软件包分析.结果 10份标本经RT-PCR提取扩增出的目的片段,4份为汉滩型(HTN型),6份为汉城型(SEO型).扩增产物测序结果与已测得国内毒株及部分国际标准株比较,4份HTN型HV之间核苷酸同源性达到95.6％ ～ 98,9％.与HTN76-118株同源性高,为89.3％～90.1％,氨基酸同源性为98.4％ ～ 99.2％.6份SEO型HV间核苷酸同源性高达98.3％ ～ 99.8％.与80-39株同源性高,为96.3％ ～ 96.6％,推导氨基酸同源性为99.3％ ～ 99.6％.结论 辽宁省是以SEO型HV为主的SEO型和HTN型混合型疫区,病毒G2基因片段间高度同源,无明显变异,遗传物质相对稳定.
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福建口岸输入登革Ⅰ型病毒E基因序列分析
目的 研究分析福建口岸输入登革Ⅰ型病毒E基因序列,为登革热诊断的分子溯源提供参考.方法 收集2012-2013年福建口岸截获的7例入境Ⅰ型登革热病例资料及血清标本,用C6/36细胞培养分离病毒,提取病毒RNA,用RT-nested-PCR扩增包含E基因全长的核酸片段,扩增产物经纯化、测序,用生物学软件进行DNA序列比对分析.结果 用C6/36细胞从7例登革热病例血清中成功分离出7株登革病毒株,经RT-nested-PCR证实均为DENV-Ⅰ型,构建E基因全长进化树分析发现,分离株与新加坡、越南和菲律宾等地的病毒株同源性高,与病例入境时进行的流行病学调查资料完全吻合.结论 从分子水平证明登革热病例血清中分离到的毒株为DENV-Ⅰ型病毒,结合流行病学调查资料,证实均为输入性感染病例,有可能来源于东南亚一带.
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广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究
[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)分子鉴定方法及其系统进化关系.[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性,设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物,对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定,并与CenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析.[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同,M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp～520bp、432bp～438bp、527bp～586bp、439bp～448bp和644bp.序列分析和系统进化关系显示,尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属,再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科,库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类,分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致.[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系.这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点,对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据.
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克拉玛依市HIV-1env gag pol基因特征变异研究
目的 研究克拉玛依市HIV-1 env、gag、pol基因特征及不同亚型混合感染情况.方法 巢氏PCR方法扩增2017年克拉玛依市HIV新发现病例env、gag、pol基因,结合已知亚型利用Mega软件分析测序结果.结果 48份样本env、gag、pol三种基因分别获得合格序列36份、35份和41份,CRF07_BC是三种基因分型的主要亚型,CRF01_AE排第二位.除此外还发现克拉玛依市存在其他亚型和重组型,HIV-1 pol基因有新型变异亚型CRF79_0107、URF_01B、URF_02B.有6份样本存在三种基因分型不完全一致情况,即不同亚型混合感染.结论 克拉玛依市HIV-1防控形势相对于新疆其他地市更加严峻,预防和控制艾滋病在不同人群间相互传播、防止混合感染为目前首要任务.
关键词： HIV-1 env、gag、pol基因 混合感染 系统进化树 亚型 -
深圳市龙岗区首次本地登革热暴发疫情的分子流行病学研究
登革热是广东省重点应对的虫媒病毒性疾病[1].2014年9月27日,深圳市龙岗区首次出现由本地登革热感染病例引起的暴发,本研究对疫情状况及其病原的分子流行病学特征进行研究.1.材料与方法:(1)流行病学调查:参照《登革热诊断标准》(WS 216-2008)对病例进行诊断,按照《登革热疫情现场调查处理规范(2006)》收集病例个案调查表及流行病学调查资料,采集病例急性期血清进行登革病毒(DENV)抗体IgM(试剂为中山生物工程有限公司产品)和DENV-1 ～4型病毒核酸检测(试剂为上海之江生物科技有限公司产品),并开展媒介调查.
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广州市2009年新出现登革3型病毒的分子流行病学分析
目的 对广州市2009年新出现的3型登革病毒(DEN)株的E基因进行RT-PCR扩增和序列测定,探讨其来源及基因型.方法 收集广州市2009年登革热患者急性期血清,用C6/36细胞培养分离DEN,RT-PCR扩增病毒全长E基因,测序并绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析.结果 2009年采集的19份患者血清标本中,分离到7株3型DEN株,RT-PCR扩增后测序获得E基因序列,7株DEN3病毒E基因均由1479个碱基组成,编码493个氨基酸,基因序列未见插入或缺失,分析发现7株病毒来自两个不同的亚型:09/GZ/1081、09/GZ/1483和09/GZ/10806属于东南亚/南太平洋型,09/GZ/10616、09/GZ/11144、09/GZ/11194和09/GZ/13105属于印度次大陆型,各亚型群内毒株序列同源性较高.结论 广州市2009年DEN3为输入性,分属两个基因型.
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基于复制酶基因序列的黄瓜绿斑驳花叶病毒系统进化及生物信息学分析
本研究对江苏、浙江、湖南和北京等四个地区的葫芦、西瓜、黄瓜、西葫芦和甜瓜上的黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV) 129 kD和57 kD蛋白复制酶基因分别进行扩增、测序和序列分析.结果显示,供试CGMMV分离物CGMMV-No.1、CGMMV-No.2、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5的129 kD和57 kD蛋白复制酶基因序列相似性分别为99.64％和99.74％,其中CGMMV-No.1、CGMMV-No.3和CGMMV-No.4的相似性较高,三者的129 kD和57 kD蛋白复制酶基因序列相似性分别为99.95％和99.94％,而CGMMV-No.2的129 kD和57 kD蛋白复制酶基因序列与其余四个参比序列的相似性相对较低,分别为99.16％～99.27％和99.04％～99.18％;供试样品在基于129 kD和57 kD蛋白复制酶基因序列构建的NJ系统发育树中均被分为6个类群,CGMMV-No.1、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4与GenBank上已报道的中国山东分离物(Accession No.KJ754195)聚为一支,CGMMV-No.5与中国辽宁分离物(Accession No.EF611826)聚为一支,而浙江的CGMMV-No.2西瓜分离物在129 kD蛋白复制酶基因系统发育树中与韩国西瓜分离物(AccessionNo.AF417242)聚为一支,其在57 kD蛋白复制酶基因系统发育树中独立成群.本研究中供试CGMMV分离物的129 kD和57 kD蛋白均无显著疏水性,也无高度卷曲螺旋部位,ProtParam预测显示仅CGMMV-No.4的129 kD蛋白为稳定蛋白,其余均为不稳定蛋白,CGMMV-No.1、CGMMV-No.2、CGMMV-No.3和CGMMV-No.5的129kD蛋白分别有6个、6个、2个和4个可能的跨膜结构区域,CGMMV-No.2、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5的57 kD蛋白分别有13个、13个和5个可能的跨膜结构域,供试样品129 kD蛋白的糖基化位点分别有2个、4个、4个、4个和4个,57 kD蛋白的糖基化位点分别有2个、5个、2个、5个和2个,其129 kD和57 kD蛋白的紊乱区、球蛋白区、磷酸化位点以及B细胞抗原表位位点均存在差异.综合分析认为,供试CGMMV分离物复制酶基因序列相似性较高,种内稳定且保守,种间差异明显;CGMMV-No.1、CGMMV-No.3、CGMMV-No.4和CGMMV-No.5与中国山东、辽宁分离物的亲缘关系较近,可能具有相同的侵染来源,而CGMMV-No.2与韩国分离物的亲缘关系较近,序列相似性高的供试样品在系统发育树中聚为一类;供试CGMMV分离物129 kD和57 kD蛋白生物信息学分析结果不具规律性.
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侵染广西罗汉果的小西葫芦黄花叶病毒的鉴定及抗血清制备
在广西临桂罗汉果花叶畸形病株上获得了一个线状病毒分离物LGL-1,寄主范围、蚜传能力测定、病毒粒子形态和细胞病理特征研究表明,它是马铃薯Y病毒科成员.采用马铃薯Y病毒科特异性简并引物做PCR扩增,并测定了分离物LGL-1的基因组3′-末端序列,序列分析表明它是小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV).系统进化树分析揭示,世界范围内的ZYMV分离物主要可分为3大群体,分离物LGL-1为中国特有群体Group Ⅲ成员.原核表达制备了分离物LGL-1的外壳蛋白抗血清,明确了ZYMV是引起广西罗汉果病害的主要病毒,并且比较了原核表达法和提纯病毒法制备的抗血清,在病样的间接ELISA法检测中结果的差异.
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中国国内首次发现Nam Dinh病毒
2009～2011年,课题组在深圳市龙岗区的致倦库蚊标本中检测到我国首株Nam Dinh病毒(Nam Dinh Virus,NDiV).本研究通过细胞培养、SYBR Green Ⅰ实时定量荧光RT-PCR和RT-PCR方法对深圳NDiV的细胞易感性和分子进化特征进行分析.结果发现4批致倦库蚊标本可以引起C6/36细胞病变.4株深圳分离株的SYBR Green Ⅰ实时定量荧光RT-PCR检测结果均出现“S”型扩增曲线与特异性的熔解曲线.对分离株的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因与部分ZmHell (Zn module+ Superfamily 1 Helicase)基因进行扩增均可以在2％琼脂糖电泳显示到目的条带.4株深圳分离毒株的RdRp基因核苷酸和氨基酸序列与越南代表株NDiV(02VN178)的同源性均达99％以上.系统进化树分析表明,4株深圳NDiV株与越南NDiV代表株的亲缘性近,属于同一个进化分支上.据文献检索表明,本文发现的NDiV为国内首次报道.
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2010年深圳地区诺如病毒的基因分型
了解2010年深圳地区诺如病毒的基因型别及分子流行病学特点.方法用诺如病毒特异性引物(GI-SKF/GI-SKR、COG2F/G2-SKR),通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行诺如病毒核酸扩增,阳性产物回收纯化并测序,用Clustal W和MEGA4.0生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析.85份阳性标本中有79株诺如GⅡ型和6株诺如GⅠ型,其中55株为GⅡ/4(2006b)型,16株为GⅡ/4(2008variant)型,2株为GⅡ/1型,4株为GⅡ/5型,2株为GⅡ/11型,1株为GI/4型,2株为GⅠ/5型,3株为GⅠ/6型.2010年深圳地区诺如病毒的主要型别是GⅠ和GⅡ,并且以GⅡ/4型为主,流行优势株为GⅡ/4(2006b).
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云南蚊虫中阿卡斑病毒的分离和鉴定
为掌握云南省德宏州芒市和瑞丽市蚊媒病毒分布状况,2010年8月用诱蚊灯采集蚊虫17种2 149只,用金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)培养法分离病毒,阳性分离物用阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)S和M片段特异性引物的RT-PCR法鉴定.从采集蚊虫中分离到能引起BHK-21细胞病变和致乳小白鼠发病死亡的2株病毒,其中DHL10M110株分离自瑞丽市迷糊按蚊(Anopheles vagas),DHL10M117株分离自芒市三带喙库蚊(Culex tritaeniorh ynchus).RT-PCR扩增获得S片段的702bp序列和M片段的456bp序列,系统进化树分析表明DHL10M110和DHL10M117株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远;与日本、韩国和中国台湾的AKV分离株亲缘关系较近,但云南株形成一个独立的小分支.2株新分离病毒的S片段与中国台湾CY-77株的核苷酸(96.6％和96.7％)和氨基酸(99.6％和100％)同源性高;M片段与日本Iriki株的核苷酸同源性高(93.2％和93.6％),与中国台湾CY-77株氨基酸同源性高(99.6％和100％);与肯尼亚MP496株核苷酸(69.7％和70.0％)和氨基酸(91.0％)同源性低.本研究证实云南省德宏州存在AKV的流行,与亚洲流行株具有较近的亲缘关系.三带喙库蚊和迷糊按蚊可传播该病毒.
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侵染陕西洋葱的胡葱黄条病毒基因组全序列分析
葱属植物病毒病害在世界范围内广泛发生,严重危害生产,如果要有效控制病害,首先需要明确病毒的种类及它们的分子生物学特征.
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番木瓜环斑病毒海南分离株全基因组序列分析
番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是马铃薯Y病毒属(genus Potyvirus)的成员之一.病毒粒体呈线状,长700～900nm,直径为12.5nm.为单分体正链RNA病毒,由多种蚜虫以非持久方式传播.依寄主范围可划分为P型和W型两种.其中P型株系(PRSV-P)是制约生产的重要病原,除了给番木瓜生产带来严重危害,也会危害葫芦科作物.W型株系(PRSV-W)是危害葫芦科作物的主要病原,虽然和PRSV-P型株系血清学反应密切相关,但不侵染番木瓜.
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首次从我国蚊虫中分离到类似广平病毒
为掌握云南省西双版纳州勐海县蚊媒病毒分布状况,用诱蚊灯采集蚊虫标本,用细胞培养法分离病毒,对阳性分离物进行分子生物学鉴定.2012年7月,在勐海县打洛镇采集蚊虫32批共1 468只,其中三带喙库蚊(Culextritaeniorh ynchus)28批1 383只,致倦库蚊(Culex quinque ascitatus)2批66只,按蚊(Anopheles)2批19只.用金黄地鼠肾细胞(Golden hamster kidney cell,简称BHK-21)和白纹伊蚊细胞(Aedes albopictus cell,简称C6/36)进行病毒分离,结果有2批三带喙库蚊标本(BNDL1205和BNDL1227)能引起C6/36细胞产生聚合病变,而不能引起BHK-21细胞病变.用黄病毒属特异性引物对这2株阳性分离物进行RT-PCR,扩增得到800bp左右的条带并进行核苷酸序列测定.对核苷酸序列的系统进化分析表明,这2株病毒与分离自越南的广平病毒(Quang Binh virus,QBV) VN 180株亲缘性近,处在同一进化分支;与VN180株的核苷酸同源性分别为83.4％和82.9％,而与既往国内外分离的18株蚊虫黄病毒的核苷酸差异较大.结果表明BNDL1205和BNDL1227病毒为类似QBV,此为国内首次报道.
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基于系统发育树的乳铁蛋白相互作用蛋白的预测
目的 利用MEGA5.05软件构建乳铁蛋白及与其相互作用蛋白的系统发育树,以进一步寻找与乳铁蛋白相互作用的蛋白质.方法 将乳铁蛋白序列及与其相互作用的蛋白质序列以FASTA格式载入MEGA5.05软件,进化树生成算法采用邻接法,校验次数为1000次,其他参数为缺省数值,生成系统进化树.结果 与乳铁蛋白相互作用的蛋白质和乳铁蛋白之间有一定的同源关系,与乳铁蛋白相互作用的蛋白质之间也有一定的同源关系.结论 通过MEGA5.05软件构建系统发育树,可以预测出乳铁蛋白与肌红蛋白、载脂蛋白D、谷氨酰胺合酶可能存在相互作用.
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福建省五条蚋和黄毛纺蚋nrDNA-ITS序列分析(双翅目:蚋科)
克隆并测定福建省五条蚋Simulium (Simulium) quinquestriatum和黄毛纺蚋Simulium (Nevermannia)aureohirtum nrDNA-ITS序列,分别与GenBank中发表的Simulium亚属和Nevermannia亚属序列进行系统进化树分析,探讨其在蚋类分子分类中的作用.结果表明,各蚋种克隆株ITS2序列均与相应物种聚类,符合形态学鉴定结果,可作为蚋种鉴定和近缘种类鉴别的遗传标记之一;ITS1序列在五条蚋中同源性较低(88.3%),不适合做分类遗传标记;黄毛纺蚋泉州、漳浦两地理株间存在变异.
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人乳头瘤病毒编码蛋白的进化分析
目的 构建20种常见高低危型HPV编码蛋白进化树,分析其进化关系. 方法 从NCBI数据库中获取常见20种高低危型HPV的8种编码蛋白完整氨基酸序列,通过MEGA6.0软件中邻位连接法(neighbor-joining,NJ)构建系统亲缘进化树,进行进化分析. 结果 低危型HPV6、11和42亚型单独处于一分支上,并与高危型HPV分开.在高危型中,HPV18、39、45、59和68亚型,HPV16、31和35亚型以及HPV33、52和58亚型的HPV基因组8种编码蛋白均分别聚集在同一支上,而高危型HPV73的8种编码蛋白在进化树上的位置均不固定.在构建的E2和E6蛋白进化树中分歧支较多,结果较不可信. 结论 在蛋白进化树中常见低危型HPV均单独处于一支,且与高危型HPV分开,12个高危型HPV分布于3个不同分支或位置不固定.
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一例儿童手足口病分离毒株特征分析
目的 了解河北地区1例儿童手足口病病原学特征. 方法 采集1例手足口病患儿支气管病理组织切片并做免疫组化分析.培养病变组织标本并分离EV71.经RT-PCR扩增EV71毒株基因及其VP1区基因,经基因测序并构建进化树,分析毒株病原特征. 结果 患儿支气管黏膜脱落,甚至发生坏死并伴有淋巴细胞浸润,局部小血管内形成小血栓.免疫组化分析,在支气管组织细胞中检测到阳性抗原信号,且主要集中在上皮细胞的胞浆内.RT-PCR扩增,EV71基因目的片段长度约为226 bp.确定EV71阳性的标本采用RT-PCR扩增EV71毒株的VP1区基因序列,目的片段大小约为839 bp.基因测序及核苷酸序列比对显示,所测序列未发生突变.构建EV71-VP1区核苷酸序列进化树,本研究中的EV71毒株属于C4亚型,其与FJ606448株的同源性达99％,未发生基因突变. 结论 本研究分离的EV71毒株未发生变异,与北京流行毒株同属于C4亚型,同源性较高,揭示人口流动对EV71病毒株传播影响的重要性,为河北地区儿童手足口病的临床防治提供指导.
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居室内检获的羽美绥螨形态和DNA条形码鉴定
目的 准确快速鉴定居室内检获的螨类.方法 对2016年7月于芜湖市某儿童房内毛绒玩具上检获的大部分螨类进行形态鉴定,对6只螨扩增线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因,基于该基因以邻接法构建已知美绥螨科螨类的系统进化树.结果 经形态鉴定,检获螨类为雌性羽美绥螨(Ameroseius plumosus),属革螨股、囊螨总科、美绥螨科.首次扩增了羽美绥螨COⅠ基因的DNA条形码,6只个体间的DNA条形码差异＜0.5％,判断这6只个体为同一种类.系统进化树显示羽美绥螨与美绥螨科的种类聚在一支.结论 首次在毛绒玩具中发现羽美绥螨.应用形态鉴定和DNA条形码相结合的鉴定方法,可有效提高医学媒介生物种类鉴别能力和准确度.
