首页 > 文献资料
-
川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选＊
目的：首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究，建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）佳反应体系。方法：以川牛膝苗期叶片为材料，利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察，建立川牛膝MSAP反应佳体系。结果：川牛膝MSAP佳反应体系为：酶切体系（20μL），300 ng DNA、1.5μL EcoRI、1.5μL HpaII或1.5μL MspI （HpaII）；连接体系（25μL）：15μL酶切产物、1μL EcoRI adaptor、1μL HpaII/MspI adaptor、0.2μL T4连接酶；预扩增体系（25μL）：连接产物1μL、rTaq酶1 U、引物分别1.5μL、dNTP 2μL；选择性扩增体系（25μL）：预扩产物稀释50倍、rTaq酶1 U、引物1.5μL、dNTP 3μL，并运用优化后的体系，终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对。结论：优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带，筛选出的6对引物组合特异性好，能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究，同时，为其他药用植物MSAP分析提供了参考。
-
单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术的探讨
目的对在单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术进行探讨.方法采用15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行引物延伸预扩增(Primer extension preamplification, PEP),取其产物5 μl分别对β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式扩增,然后采用反向斑点杂交(Reverse dot blot, RDB)技术检测β地贫突变型.结果将这些技术应用于4例已经确定突变基因型的β地贫患者及1例正常女性,检测结果与预料的相符.结论结合我们的实验结果,提示在单个细胞或微量DNA模板水平运用基因芯片技术进行遗传病检测是可行的,而且将来在胚胎植入前基因诊断和无创性产前诊断领域可能有一定的实用价值.
-
预扩增qPCR方法检测少量小鼠早期胚胎细胞中DNA甲基化相关基因的表达
目的:比较3种实时定量PCR(qPCR)方法对少量小鼠早期胚胎细胞中甲基化相关基因表达水平的检测效果,以期获得适合日常检测的方法.方法:分别应用常规qPCR方法、基于等温预扩增的qPCR方法、基于PCR预扩增的qPCR方法3种方案对少量小鼠早期胚胎细胞样本中甲基化相关基因TET1、TET2、TET3、DNMT3A的mRNA表达进行检测.结果:3种方法的灵敏度由高到低依次为基于等温预扩增的qPCR方法、基于PCR预扩增qPCR方法、常规qPCR方法.前两种方法均能在合适的循环数下对少量小鼠胚胎细胞中的多个甲基化相关基因表达进行定量.而基于PCR预扩增的qPCR方法比基于等温预扩增的qPCR方法更经济,适合日常检测.因此,我们选择应用基于PCR预扩增的qPCR方法,检测了小鼠卵细胞以及卵细胞受精后22 h甲基化相关基因表达的变化,结果发现该过程中TET1表达量很低,不易检测到;TET2表达呈降低趋势;TET3和DNMT3A表达显著升高(P＜0.01),与文献报道基本一致.结论:基于等温预扩增的qPCR方法检测少量细胞样品中甲基化相关基因的表达的灵敏度在3种qPCR方法中高.而基于PCR预扩增的qPCR方法操作简单、灵敏度较高、成本相对低,适合少量细胞样本中多个相关基因表达的实时定量日常检测.
