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QPCR芯片技术及其在皮肤科学研究中的应用前景
摘要实时定量PCR(Qpcr)基因芯片能够对基因表达的特异性等进行综合的分析与判断,迅速将某个或几个基因与病变联系起来,也为进一步研究基因间相互作用关系提供参考.本文介绍了Qpcr基因芯片技术的基本原理、在生物科学、医学等方面的应用及探讨其在皮肤科学中的应用前景.
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优化和验证人精浆miRNAs提纯方法
目的 优化精浆miRNAs提纯方法,为后续实验奠定基础. 方法 收集国家卫生计生委科研所生殖健康服务中心正常精液样本5例,非梗阻性无精子症(NOA)患者(经北京大学第三医院检查确诊)精液样本22例.根据不同RNA提取方法分为4组:Trizol LS组、蛋白酶K+Trizol LS组、miRNeasy Micro kit组及Trizol LS+miRNeasy Micro kit联合使用组(改良组).比较4组提纯NOA患者精浆RNA的OD260/280,使用Agilent2100生物分析仪检测改良法提纯精浆miRNAs的纯度和质量,采用实时定量PCR方法比较4组精浆miR-106b的溶解曲线,并比较精液参数正常组(n=5)和NOA患者组(n=10)精液样本中的miR-106b的表达量. 结果 改良组提纯精浆RNA的OD260/280为(1.90±0.03)显著高于其他3组(P<0.05);改良组提纯精浆miRNAs的完整数合格,色谱图位置特异性明显,峰值清晰;4组miR-106b的溶解曲线中,改良组曲线符合标准;NOA患者精浆中miR-106b的表达丰度显著低于参数正常组(P<0.01). 结论 Trizol LS与miRNeasy Micro kit联合使用提纯的精浆miRNAs质量好,能满足后续实时定量PCR、深度测序等实验要求.小样本分析发现NOA患者精浆miR-106b含量显著低于精液参数正常组,有待大样本验证其是否能作为临床诊断NOA的分子指标.
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电离辐射致人外周血淋巴细胞mtDNA 4977 bp缺失分析
DNA是电离辐射的重要靶分子之一,从碱基损伤到糖基破坏,导致DNA链断裂,DNA交联与整个或部分高级结构的变化,终影响其生物学功能[1].线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)是线粒体基质中的裸露分子,由于缺乏组蛋白保护和修复系统功能的欠缺,mtDNA比核DNA(nDYA)更易受到损伤,导致mtDNA突变,与生物衰老、神经肌肉性疾病、糖尿病及肿瘤的发生有着很密切的关系[2].
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷对苯诱导大鼠骨髓细胞周期改变的体外试验
目的 探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza)对苯处理大鼠骨髓细胞(BMC)周期的影响及其作用机制.方法 以指数生长期的正常大鼠BMC作为空白对照组,以10 mmol/L苯处理BMC 24 h为苯处理组,苯处理后用10 μmol/L 5-aza处理72 h为苯+5-aza处理组;运用流式细胞术检测细胞周期变化,实时定量PCR检测Cyclin D1和p27mRNA表达的变化,Western blot检测Cyclin D1和p27蛋白表达的变化.结果 与对照组比较,苯处理组细胞S期比例显著增高42.5%,G1期比例下降31.5%(P<0.01),同时伴随Cyclin D1 mRNA和蛋白表达显著增加,p27 mRNA和蛋白的表达显著下降(P<0.01);与苯处理组相比,苯+5-aza处理组G1期比例上升52.7%,S期比例下降56.2%(P<0.01),同时伴随Cyclin D1、p27 mRNA和蛋白的表达发生显著性的逆转(P<0.01).结论 5-aza逆转苯所致的细胞周期改变,伴有Cyclin D1和p27表达改变.
关键词： 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 苯 细胞周期 实时定量PCR -
茎环法与加PolyA尾法PCR在检测MicroRNA时引物设计的策略
MicroRNA (miRNA)是一种长约18 ～ 25个核苷酸的非编码RNA,对基因的表达调控发挥着重要的作用.对于miRNA的实时定量PCR与以往的PCR有些不同,这主要是因为miRNA的自身结构比较特殊.其大的特点就是长度过于短小,仅仅二十几个碱基的核酸片段无法直接应用常规的PCR技术扩增.所以,在针对miRNA的PCR技术中,必须要延长待测miRNA的长度,构建出一个足够长的PCR模板,才能进一步应用PCR技术来定量分析.本文介绍的2种方法,茎环法和加尾法,在原理上有所差异.茎环法的原理是,设计一种特殊的茎环结构的反转录引物,在反转录反应中直接完成模板链的延长;而加尾法的思路则是先对miRNA进行加PolyA尾处理,改造成mRNA的结构,再采用mRNA常用的oligo (dT)反转录引物进行反转录,从而得到较长的模板链.
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1-溴丙烷引发雄性大鼠性腺基因表达谱的变化
目的 研究1-溴丙垸(1-BP)诱发大鼠性腺基因表达谱的变化,探索1-BP雄性生殖毒性相关的mRNA改变.方法 雄性F344/NSIc大鼠12只,随机分为2组,分别吸入新鲜空气或5030 mg/m3 1-BP 8h.染毒后16h处死大鼠取出睾丸,运用大鼠性腺cDNA微阵列和real-time PCR方法测定1-BP染毒后性腺相关基因表达谱的变化.结果 在大鼠性腺芯片5087个cDNA微点阵中,有62个基因被1-BP显著下调,3个基因显著上调.其中包括性激素合成相关基因细胞色素P450芳香化酶(CYPl9a),谷胱苷肽S-转移酶(GSTT1),肌酸激酶(Ckb),髓鞘和淋巴细胞蛋白(Mal)和S100的钙结合蛋白(S100a4).归类分析结果显示绝大多数变化的基因与蛋白质/脂类代谢相关,其次与应激防御反应相关.实时定量PCR证实了1-BP可引起CYP19a、S100a4、GSTT1和Mal的下调.结论 急性高剂量染毒1-BP可引起睾丸组织CYP19a、S100a4、GSTT1、Mal等基因的下调,提示其可能通过内分泌干扰和氧化应激效应而导致雄性生殖毒性.
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两种实时定量PCR技术检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA的比较研究
目的 比较结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测技术(简称Xpert MTB/RIF)和达安实时定量PCR检测肺泡灌洗液中的结核杆菌DNA对肺结核的诊断和卫生经济学价值.方法 招募2014年3月～2015年11月进入第四军医大学西京医院就诊的疑似肺结核的连续病例112例,收集肺泡灌洗液样本同时进行抗酸染色、MGIT960液体培养和药敏试验、Xpert MTB/RIF和达安实时定量PCR检测.结果 112例纳入的研究对象中经培养确诊的肺结核患者有53例,疑似的肺结核患者15例,非结核患者44例.以MGIT960液体培养为金标准,Xpert MTB/RIF与达安实时定量PCR的灵敏度差异无统计学意义(98.11％ vs90.57％,P=0.205),两者的灵敏度均高于抗酸染色灵敏度58.49％ (P＜0.001);而若以临床诊断为参考标准,Xpert MTB/RIF的灵敏度则高于达安实时定量PCR,且差异有统计学意义(P=0.045).而抗酸染色、达安实时定量PCR和Xpert MTB/RIF的特异性分别为99.73％、88.64％和95.45％,差异无统计学意义(P=0.184).进行成本-效果分析,每检出1例肺结核行1次Xpert MTB/RIF的费用为1 033.85元,远远高于达安实时定量PCR费用196.49元.结论 Xpert MTB/RIF灵敏度高,操作更加简便快速且易于开展,并能同时检测利福平耐药性,可作为检测肺泡灌洗液中结核分枝杆菌DNA的首选方法.但达安实时定量PCR的检测成本较低,更加适用于低收入人群.
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实时荧光定量PCR检测普氏立克次体
目的 采用新型TaqMan-MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法.方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因(ompB)序列设计引物和探针,以克隆的ompB基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999);与巢式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍.用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA,检出结果均为阴性.用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本,某些样本检测为阳性,而用巢式PCR检测的结果均为阴性.结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA,可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒.
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实时荧光定量PCR检测汉赛巴通体
目的 采用新型TaqMan-MGB探针建立检测汉赛巴通体的实时荧光定量PCR方法.方法 根据汉赛巴通体特异的16S～23S rRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的16S～23SrRNA间隔区基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900HT)上建立实时荧光定量检测方法,对所建立的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析,并且对模拟标本进行检测.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其1000倍.用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,除军团菌检出微弱信号(2个拷贝)外,其余检出结果均为0;对重复性进行了评价,批内和批间的变异系数在0.2%～1.9%之间.用荧光定量PCR检测汉赛巴通体感染的小鼠血标本,在感染后第2天、第3天、第5天,检出少量的汉赛巴通体,在感染后的第1天和第2天从脾脏样本中检出大量的汉赛巴通体.结论 检测汉赛巴通体实时荧光定量PCR方法具有高度特异性和高敏感性以及良好的重复性,可用于快速检测各种样本中的微量汉赛巴通体以及作为汉赛巴通体感染的实验室诊断.
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苏木对C57BL/6荷瘤小鼠骨髓CK18、CK19 表达影响的实验研究
目的 通过检测荷瘤小鼠骨髓中细胞角蛋白CK18、CK19的mRNA表达,研究苏木对肿瘤转移的影响.方法 建立Lewis肺癌C57BL/6小鼠肿瘤模型,将小鼠随机分为苏木低剂量组(SML组)、苏木高剂量组(SMH组)、化疗组(CTX组)、化疗+苏木低剂量组(CTX+SML组)、化疗+苏木高剂量组(CTX+SMH组)、荷瘤对照组(NS组)6组,分别给予不同剂量苏木煎剂灌胃(每日1次)、环磷酰胺(接种后24 h腹腔内注射1次).在实验的第7、14、21天分批处死小鼠,摘取肺脏,观察肺转移灶;并采用实时定量PCR技术检测小鼠骨髓CK18、CK19的mRNA表达.结果 CK18 mRNA表达,第7天CTX组和CTX+SMH组、第14天SMH组和CTX+SMH组、第21天CTX+SMH组与同时点NS组比较,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01、P<0.01).CK19mRNA表达.第7天SMH组、CTX+SMI.组、CTX+SMH组与NS组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05);CTX+SMH组与CTX组比较,差异有统计学意义(P<0.05);第14天、第21天各用药组均较NS组表达低,差异无统计学意义(P>0.05).各组小鼠第7、14天均未见肺转移灶,第21天各组均町见肺转移灶;用药各组肺转移灶数目均少于NS组,与NS组比较差异均有统计学意义,SML组(P=0.01 17)、SMH组(P=0.0042)、CTX组(P=0.0001)、CTX+SML组(P=0.0001),CTX+SMH组(P=0.0001);CTX+SML组的肺转移灶少于CTX组(P=0.0237).各组肺转移灶的形态也存在较大差异.结论 苏木具有抑制肿瘤转移的作用,苏木加化疗的抑制作用优于单纯化疗或者单纯苏木治疗.
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一个糖尿病家系中肾虚证相关功能类基因的筛选及验证
目的:筛选糖尿病家系中与肾虚证相关的特征功能类基因.方法:对一个2型糖尿病( T2DM)家系的6个成员进行辨证和理化检测,选择不同代的糖尿病肾虚证3例及家系中的正常人1例作基因芯片实验；采用芯片显著性分析( SAM)软件筛选显著表达基因.另外,再选取T2DM肾虚证患者及健康者各9例分别为实验组和对照组,采用实时定量PCR( qPCR)技术对筛选到的特征基因在T2DM中的表达进行验证.结果:共筛选到70个显著表达基因,功能注释结果提示免疫反应功能类基因及细胞因子通路显著表达.qPCR法验证了AZU1、CCR3、IL20RA 3个基因.其中,CCR3和IL20RA在T2DM肾虚证患者中的表达低于对照组(P＜0.05).结论:免疫功能异常可能是该家系发生糖尿病肾虚证的分子基础.
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SYBR实时定量PCR法评价药物抗鸭乙肝病毒方法的研究
先天感染鸭乙肝病毒(D-HBV)动物模型是国内外筛选抗乙肝病毒(HBV)药物、研究药物作用机理较为公认的模型[1,2],采用SYBR实时定量PCR方法筛选动物模型并定量观察用药前后血清DHBV-DNA水平变化有利于客观评价药物疗效.
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大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期、早期和晚期基因转录水平的影响
目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(ie)、早期(e)和晚期(1)基因在转录水平的影响,探讨大蒜新素抗HCMV效应的作用机制.方法 建立HCMV AD169株(MOI =2.5)感染细胞和大蒜新素(9.6 mg·L-1)处理感染细胞模型,并用相应剂量(2.3 mg·L-1)的更昔洛韦(GCV)作比较,用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞感染后0.5,2,4,6,12,24h病毒u1122,ul123,ul54,ul83 mRNA水平的动态变化.结果 大蒜新素处理组ul122,ul123 mRNA的表达量始终明显低于感染对照组(P＜0.05),而更昔洛韦处理组ul122 mRNA在0.5 ～6 h与病毒对照组无明显差异.大蒜新素对AD169 ul122,ul123 mRNA的抑制率在感染后24h分别为75.2%,70.4%.2药物处理组ul54 mRNA表达量始终低于病毒对照组(P＜0.05),大蒜新素和更昔洛韦对ul54 mRNA的抑制率在感染后24h分别为45.4%,27.2%.在感染后6h各组ul83 mRNA表达明显增多,以病毒感染对照组变化为明显.大蒜新素和更昔洛韦对ul83 mRNA的抑制率在感染后24h分别为45.9%,26.2%.结论 大蒜新素可显著抑制HCMV AD169毒株ie基因(ul122和ul123)的转录,导致其mRNA表达明显降低,对e基因(ul54)和l基因( ul83)转录水平亦有所抑制,表明病毒ie基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要环节.
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菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析
根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式.IiHCT ORF为1 290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa.IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达.同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4h达到原先的4.3倍.研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础.
关键词： 菘蓝 莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶 克隆 实时定量PCR 表达分析 -
罗汉果实时荧光定量PCR内参基因的选择
罗汉果为药食两用的传统中药,研究从罗汉果转录组中选取了Actin,18 SrRNA,ubiquilin,efl-α,ef1-β,Tubulin作为候选基因,通过实时荧光定量PCR,利用geNorm,NormFinder,BestKeeper,Delta CT,RefFinder软件和方法对6个候选参考基因在不同罗汉果样品中的表达稳定性进行分析,首次筛选出了不同时期的有籽和无籽罗汉果果实中较理想的内参基因,结果发现18SrRNA在所有罗汉果样品中表达稳定,是样品基因分析适合的内参基因,对采用qRT-PCR方法分析罗汉果基因表达中内参基因的选择具有指导作用,也为罗汉果生物合成途径基因及其他不同条件下基因差异表达研究提供参考,确保罗汉果基因表达分析结果的可靠性.
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铁皮石斛锌铁调控转运蛋白基因的克隆与表达分析
锌铁调控转运蛋白(ZRT,IRT-like protein,ZIP)在植物生长发育过程中起重要的调控作用.研究采用实时定量PCR(QPCR)和RACE技术,首次从珍稀濒危兰科药用铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到1个ZIP基因cDNA全长,命名为DoZIP1,提交GenBank获得注册号KJ946203.生物信息学分析显示,该基因开放阅读框1 056 bp,编码1条由351个氨基酸组成的肽链,相对分子质量37.57 kDa,等电点6.09.推定的DoZIP1蛋白具有保守的锌铁调控转运相关蛋白结构域,二级结构包含α螺旋50.71％、延伸链11.11％、β转角1.99％与随机卷曲36.18％,具有信号肽和8个跨膜域,预测定位在质膜.该蛋白质氨基酸序列与拟南芥、苜蓿、水稻等物种ZIP蛋白相似性较高,系统进化分析表明其与AtZIP10,OsZIP3蛋白的亲缘关系较近,聚在一个分支.QPCR分析表明,DoZIP1基因转录本在根中相对表达量较高,为茎中的4.19倍;叶次之,为茎的1.12倍.DoZIP1基因的分子特征为下一步研究其在铁皮石斛生长发育过程的生物学功能奠定基础.
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同时检测新甲型H1N1及人季节性H1N1和H3N2流感病毒的单管多重荧光定量PCR方法
本研究设计的一种4重荧光定量RT-PCR检测方法,以A型流感病毒各亚型的血凝素基因(HA)为检测靶标,实现了同时检测新甲型H1N1流感病毒、人季节性H1N1流感病毒和人季节性H3N2流感病毒.本法使用人细胞RNA酶P基因作为内参,以判断标本来源和实施质量控制.利用不同来源和哑型的流感病毒验证了该方法的特异性;利用连续稀释的新甲型H1N1流感病毒HA全基因体外转录物进行灵敏度分析.结果表明该方法灵敏度高,可检测低至20个拷贝的RNA;特异性强,每对引物只检测出对应的病毒,无交叉反应;并且成功地验证性检验了34份新甲型H1N1流感病毒阳性临床标本和20份人季节性H1N1和H3N2流感病毒及人乙型(HB)流感病毒阳性临床标本.因此,该多重荧光定量RT-PCR法是一种可同时检测2009年新甲型流感病毒及季节性流感病毒的有效方法.
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A组轮状病毒实时定量PCR检测方法的研究进展
A组轮状病毒是引起婴幼儿急性肠胃炎的主要病原之一.目前已建立的轮状病毒检测方法有电镜检测、酶免疫法、反转录PCR法、实时定量PCR法.实时定量PCR法与其他方法相比具有特异性强、敏感度高、可以分型、定量准确等优势.本文就实时定量(Real-time) PCR技术应用于A组RV检测的研究进展进行简单概述.
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应用实时定量PCR技术研究人重组干扰素α2b在人群中对麻疹病毒和风疹病毒的抑制作用
麻疹病毒(measles virus)是一种导致麻疹的副粘病毒科麻疹病毒属的单股负链RNA病毒.麻疹是儿童常见的一种急性呼吸道传染病.临床上以发热、上呼吸道炎症、结膜炎、口腔粘膜斑及全身丘疹为特征[1].风疹病毒(rubella virus,RUV)属于披膜病毒科风疹病毒属.孕妇特别是怀孕3个月以内的孕妇感染风疹病毒后,可以引起胎儿畸形.麻疹病毒和风疹病毒的实验室检测包括病毒分离、病毒特异性IgM的检测、分子杂交直接检测病毒RNA、RT-PCR、RT-nested PCR(RT-nPCR)等[2-3].
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小鼠间充质干细胞脂向分化过程中miRNA-143的表达
目的 探讨小鼠间充质干细胞(MSCs)脂向分化过程中miRNA-143 (miR-143)的表达,为阐明MSCs脂向分化的调控机制提供新线索.方法 采用全骨髓体外分离结合差速贴壁法纯化扩增C57BL/6小鼠MSCs,将第5代MSCs采用脂肪细胞分化诱导剂进行成脂诱导.运用miRNA芯片技术比较MSCs组和脂肪细胞组中miR-143的表达,并通过实时定量PCR技术验证.结果 成功分离、纯化和培养MSCs；MSCs经脂肪诱导剂诱导后,胞内大量脂滴形成,油红O染色阳性.MiRNA芯片及实时定量PCR结果均表明miR-143在MSCs脂向分化过程中显著上调(3.73 ±0.42vs1.00 ±0.14,P＜0.01).结论 miR-143可能参与调控MSCs的脂向分化.
