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蓝谱Loopamp? LA-500实时浊度基因检测系统
针对LAMP?方法生产的专用检测系统，可在恒温条件下（60~65℃）将扩增和检测同步完成，具有16个独立的试管通道，多可扩展至96个通道，仪器每6秒自动收集一次浊度信号，在液晶屏上实时显示结果，内置热敏打印机，结果可直接打印。该仪器能特异的进行引物筛选、能对佳引物浓度和反应时间进行控制，以及对非特异性扩增进行判断。
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蓝谱Loopamp?LA-500实时浊度基因检测系统
针对LAMP?方法研发的专用检测系统，可在恒温条件下（60-65?C）将基因扩增过程与结果检测同步完成。每个扩增模块具有16个独立检测通道，全套系统可扩增至6个模块96个检测通道。每6秒自动检测一次浊度信号，液晶屏实时显示结果，内置热敏打印机，可直接输出结果。该仪器可进行特异性引物筛选，对佳引物浓度及佳反应时间进行控制，对非特异性扩增进行判断。
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川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选＊
目的：首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究，建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）佳反应体系。方法：以川牛膝苗期叶片为材料，利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察，建立川牛膝MSAP反应佳体系。结果：川牛膝MSAP佳反应体系为：酶切体系（20μL），300 ng DNA、1.5μL EcoRI、1.5μL HpaII或1.5μL MspI （HpaII）；连接体系（25μL）：15μL酶切产物、1μL EcoRI adaptor、1μL HpaII/MspI adaptor、0.2μL T4连接酶；预扩增体系（25μL）：连接产物1μL、rTaq酶1 U、引物分别1.5μL、dNTP 2μL；选择性扩增体系（25μL）：预扩产物稀释50倍、rTaq酶1 U、引物1.5μL、dNTP 3μL，并运用优化后的体系，终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对。结论：优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带，筛选出的6对引物组合特异性好，能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究，同时，为其他药用植物MSAP分析提供了参考。
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高皂苷人参株系早期筛选的研究
通过PCR引物检测人参DNA特异性片段,快速、准确的评价低龄人参种质质量,加快人参育种进程.该研究基于个体之间的基因差异,设计7对引物,通过比对不同人参DNA的扩增图谱与皂苷含量相关性,成功得到一对特异性引物GC1,并采用L16(45)正交试验优化其25 μL PCR体系,各组分佳配比为:DNA2.60 mg·L-1,Mg2+ 1.44 mmol·L-1,dNTP 0.19mmol·L-1,引物0.32 μmol·L-1,Taq0.076 U·μL-1.对GC1引物进行验证,在24株供试人参中有2株扩增出1 200 bp特异性条带阳性样品,2株阳性样品中9种单体皂苷及其加和值含量均较高.该特异性条带序列与甘油-3-磷酸脱氢酶同源性达99％.GC1可以作为一种高皂苷人参株系早期筛选鉴定方法的特异性引物,有利于加快人参育种进程.
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8种细菌随机扩增多态性DNA引物筛选与反应体系优化
随机扩增多态性DNA(RAPD)是一种新兴的基因分型方法,可对细菌等病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子微生物学的追踪调查及医院感染的分析[1].该方法的大特点是可对模板序列未知,而随机引物可以是任意10个bp的单链寡聚核苷酸片段.本研究以临床常见的8种细菌为对象,各筛选200条随机引物,并应用反应曲面设计(RSD)方案[2]对反应体系中关键反应成分(模板、引物及镁离子)浓度进行了优化,旨在为相关细菌的RAPD反应体系标准化及分型提供科学依据.
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三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选
目的 研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)反应体系.方法 以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的佳反应体系.结果 建立的MSAP佳反应体系为酶切反应;Hpall/Mspl 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应;总体积20 μL,连接产物2μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg2+ 1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2U;选择性扩增反应;总体积20 μL,稀释200倍的预扩增产物5μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+ 1.250mmol/L,Taq DNA酶1 U.利用优化的体系,终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对.结论 建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究.
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关黄柏DNA限制性片段引物筛选
目的:通过AFLP指纹图谱构建筛选适宜关黄柏(Cortex Phellodendri Chinensis,下同)的特定引物,改多态性引物可以直接应用于不同种群黄柏遗传多样性分析.方法:采用适宜的总DNA提取方法获得目的基因组,通过限制性内切酶和连接酶消化,预扩增和选择性扩增等手段对64种引物组合进行凝胶分析.结果:变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,3-1,3-2,3-3,3-5,5-6,6-1,6-5,8-5,9-7,9-8.10对引物组合多态性丰富.结论:该方法适用于关黄柏遗传多样性实验分析.
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实验兔RAPD反应体系的优化及引物筛选
目的 建立实验兔随机扩增多态DNA(RAPD)的优反应体系,并对RAPD引物进行筛选优化.方法 以白毛黑眼(WHBE)兔,日本大耳白(JW)兔,新西兰(NZW)兔为实验材料,对影响RAPD反应的各因素进行优化,摸索出佳的Mg2+,dNTP,Taq酶,引物和DNA模板的浓度,并从60个随机引物中筛选出适合实验兔RAPD反应的引物.结果 优RAPD-PCR反应体系为:在20 μl的反应体系中,Mg2+1.5 mmol/L,dNTP 0.25 nmaol/L,Taq酶1.25 U,引物5 μmol/L,模板DNA 40 ng.60个RAPD引物中剔除了重复性差,条带模糊的引物后,有25个引物稳定,扩增出来的条带清晰、多态性高.结论 本研究筛选出的25个引物和建立的PCR体系可应用于实验兔的RAPD反应.
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淋球菌RAPD分型的引物筛选与应用
目的为了研究不同淋球菌菌株的基因多态性,了解不同菌株之间的亲缘关系,选择适当的随机引物.方法以淋球菌基因组DNA为模板,对淋球菌进行RAPD扩增,选择多态性好、重复性好、稳定性强的随机引物,并用S38号引物对不同淋球菌基因组DNA进行指纹图谱区分.结果从Sagon公司50条RAPD随机引物中筛选出8条扩增效果良好的引物,经RAPD扩增出的淋球菌指纹图谱间有明显不同的DNA多态性,可对不同菌株进行聚类分析.结论利用RAPD技术对淋球菌进行随机引物的筛选,可为今后淋球菌的分子流行病学研究奠定基础.
关键词： 淋球菌 基因分型 引物筛选 随机扩增多态性DNA -
一种高效筛选公共引物的方法
目的：设计一种筛选高效性多重聚合酶链反应（multiplex polymerase chain reaction，MPCR）公共引物的新方法。方法将3条正向引物和3条反向引物序列分别连接于一段人类β-actin基因序列5'和3'端，连接序列通过pMD19-T载体构建质粒模板，利用此构建的质粒模板可实现9对引物PCR扩增敏感性的筛选，实现了引物的高效筛选；其步骤包括：引物设计、插入序列的选择、酶切转化、质粒提取、敏感性检测。结果通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物得出实验结果，结果显示9对公共引物的重复敏感性有明显差异，其中2对引物两次敏感性检测均达到10 copies/μL，1对引物两次敏感性均是103 copies/μL。结论该方法适用于从多对引物中排除低效性引物，筛选出敏感性高的引物对。
关键词： 引物筛选 公共引物 多重聚合酶链反应(MPCR) -
水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选
目的 优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物.方法 采用L16(45)正交设计方法,以TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSR-PCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证.采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定佳退火温度.结果 终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR佳反应体系,即包含TaqDNA聚合酶0.7U、dNTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg2 1.5mmol/L.在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定佳退火温度.结论 经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定.
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当归ISSR-PCR反应体系的建立优化及引物筛选
目的 建立并优化当归的ISSR-PCR反应体系,并进行引物筛选.方法 以当归基因组DNA为模板,通过单因素实验研究了ISSR反应体系中主要成分(Taq DNA聚合酶、dNTP、模板、引物)以及热循环参数(退火温度、退火时间、变性时间、延伸时间、循环数)对扩增结果的影响.结果 找出了各自的适条件,建立了适合当归ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在20μl反应体系中,内含10×Taq Buffer(含1.5 mmol·L-1MgCl2)、1.25U TaqDNA聚合酶、250 μmol·L-1dNTP、40 ng模板、0.25 μmol· L-1引物.扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸150 s,循环结束后72℃延伸7 min,-4℃保存.结论 以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出17条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物.该研究为当归药材DNA鉴定、种质资源研究以及优良品种选育奠定了基础.
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桔梗ISSR反应体系的建立和优化
目的 建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序.方法 采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选.之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选.结果 桔梗ISSR-PCR的佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+ 1.50mmol/L、模板DNA10ng.利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的佳退火温度为55℃和循环次数为45次.结论 建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究.
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药用甘草SSR-PCR反应体系的优化与引物筛选
目的 为了有效地确定甘草SSR-PCR反应体系,进一步筛选具有多态性的甘草SSR引物.方法 采用正交设计试验L16 (45)结果 建立了适合甘草SSR-PCR反应的佳体系,20μl体系中各组分的浓度分别为:2.0 μl 10×Buffer,Mg2+浓度为1.0 mmol/L模板DNA浓度30 ng/20 μl,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓为0.3 μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.0 U/20 μl.利用优化体系对69对SSR引物进行了筛选,共筛选出33对在4种药用甘草中均能有效扩增且多态性较好的SSR引物.结论 该研究为利用SSR标记对甘草属植物的遗传多样性分析、分子辅助育种、指纹图谱构建和物种鉴定及野生资源保护等工作提供技术支撑.
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云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化
目的 建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物.方法 利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测佳退火温度.结果 首次建立了云南沉香ISSR-PCR的佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+ 3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、dNTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的佳退火温度为53.0℃.并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础.
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三桠苦ISSR反应体系的优化与引物筛选
目的 构建三桠苦ISSR反应体系,为三桠苦种质资源遗传多样性分析及分子鉴定奠定基础.方法 通过设定影响三桠苦ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测不同反应体系的扩增效果,对条件进行优化,并筛选引物及退火温度,建立三桠苦ISSR-PCR适反应体系,并用23个不同三桠苦样品验证体系稳定性.结果 首次建立了三桠苦ISSR佳反应体系(25 μl):Master Mix 12.5 μl(Mg2+浓度4 mmol/L,dNTP浓度0.4mmol/L)、引物0.6μmol/L、模板DNA 20ng.利用该体系从60条ISSR引物中筛选出了扩增条带清晰、多态性好的12条引物.结论 所建立的三桠苦ISSR反应体系稳定可靠、标记位点清晰、检测多态性能力强,这一体系的建立及引物筛选可应用于三桠苦种质资源评估及遗传多样性分析的研究.
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金槐ISSR-PCR反应体系的优化和引物筛选
目的 优化和建立稳定的金槐ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR-PCR引物.方法 采用L16(45)正交设计方法,以dNTP、Tap酶、ISSR引物、Mg2+浓度和模版DNA 5个影响因素进行4水平优化试验,并对反应体系进行验证;采用优化所得的佳反应体系进行引物筛选.结果 确立了金槐的佳ISSR-PCR反应体系:即在25μl总体积反应体系中包含10×Buffer2.5μl,MgCl2 2.5mmol·L-1,ISSR引物0.6μmol·L-1,dNTPs0.25mmol·L-1,Taq酶1.0U,模板DNA约50ng.通过佳体系进行引物筛选,获得11条适宜金槐扩增的ISSR引物.结论 经过12份金槐样品的验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于金槐遗传多样性、指纹图谱和标记辅助育种等方面的研究.
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广西产拳卷地钱DNA的SCoT-PCR引物筛选及反应体系优化
目的:通过筛选引物并优化反应条件,建立以目标起始密码子多态性(SCoT)技术进行标记的广西产拳卷地钱DNA的聚合酶链式反应(PCR)体系.方法:采用改进的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法提取广西产拳卷地钱药材样品DNA,以凝胶电泳法与紫外分光光度法考察样品DNA的纯度和浓度;以样品DNA为模板,对36条SCoT引物进行PCR扩增反应,并对产物进行电泳、染色、成像以筛选合适引物;以DNA浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度等5个主要因素进行5因素4水平的正交试验,对SCoT-PCR反应体系条件进行优化.结果:所提取的样品DNA条带整齐,无RNA污染、无降解、无弥散荧光,加样孔清晰;260、280 nm紫外波长处吸光度比值在1.8～2.0范围内,样品DNA纯度和浓度均适合后续试验;36条引物PCR结果显示,4号引物所得产物条带整齐、无弥散荧光且亮度高,故以其为引物进行PCR反应;佳SCoT-PCR反应体系为30.00μg/mL DNA、2.00 mmol/L Mg2+、0.20 mmol/L dNTP、0.40μmol/L引物、0.50 U/mL Taq DNA聚合酶(总反应体积20μL).结论:筛选得到合适的样品DNA的SCoT-PCR引物并优化了反应体系,可为广西产拳卷地钱的品种鉴定、遗传多样性评价及亲缘关系分析提供技术基础.
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5个S180克隆细胞株RAPD特征及S180-S2D9传代细胞生物学特性研究
目的研究5个S180克隆细胞株随机扩增多态性DNA(RAPD)特征以及S180-S2D9传代细胞的生物学特性. 方法运用23条引物对S180-S2D9、 S180-S2D7、S180-S1F11 、S180-S1H10 、S180-S1B11的基因组DNA进行RAPD-PCR扩增,以琼脂糖电泳观察结果;对S180-S2D9原代、25代、50代、75代细胞基因组DNA,进行RAPD分析;计数染色体数目;原代、50代细胞分别接种入KM小鼠腹腔,观察腹水的生长情况及小鼠的存活天数;流式细胞仪测DNA含量. 结果筛选出3条在各克隆株扩增产物间有差异的引物,通过这3条引物分析S180-S2D9的RAPD特征,原代、25代、50代、75代细胞之间的RAPD条带无差异;原代、25代、50代、75代细胞的染色体数差异无统计学意义.原代、50代细胞分别接种于10只昆明小鼠腹腔,两组的存活天数分别为13～23 d、13～20 d,原代与50代组存活天数的差异无统计学意义.流式细胞仪测DNA相对含量分别为0.3890、0.3542、0.3575、0.3984.以上结果提示,S180-S2D9传到75代时未发现遗传变异. 结论可以运用RAPD-PCR技术对克隆细胞株进行质量控制.S180-S2D9克隆株性质均一,致瘤特性稳定.
关键词： S180克隆细胞株 引物筛选 S180-S2D9细胞 RAPD特征 -
胡黄连SRAP反应体系的建立与引物筛选
目的:建立胡黄连SRAP的反应体系,并筛选出适合胡黄连的引物组合,为胡黄连的遗传多样性研究奠定基础.方法:采用5因素(dNTP、Mg2+、Taq酶、引物、DNA)4水平正交试验一步法建立SRAP -PCR的反应体系,采用梯度温度法筛选PCR反应程序的佳退火温度,对已发表的SRAP引物组合进行了筛选.结果:胡黄连SRAP - PCR的佳反应体系,即20μL反应体系:10×buffer 2μL,dNTP 150μmol·L-1,Mg23 mmol·L-1,Taq酶2U,引物为0.5μmol·L-1,DNA为20ng,DMSO 1μL;适的退火温度是30.0℃～33.2℃:适的引物组合为Me1Em1,Me1Em2,Me1Em3,Me3Em3,Me1Em4,Me2Em4,Me3Em4,Me4Em4,Me1Em5,Me3Em5,Me4Em5,Me3Em6,Me4Em6.结论:该体系是适合胡黄连SRAP - PCR反应的适宜体系,为今后胡黄连遗传多样性研究奠定了基础.
