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川牛膝MSAP反应体系的优化及引物筛选＊
目的：首次对川产道地药材川牛膝表观遗传多样性进行研究，建立并优化川牛膝甲基化敏感扩增多态性技术（MSAP）佳反应体系。方法：以川牛膝苗期叶片为材料，利用正交试验设计对川牛膝MSAP反应体系中预扩增和选择性扩增中关键影响因素进行考察，建立川牛膝MSAP反应佳体系。结果：川牛膝MSAP佳反应体系为：酶切体系（20μL），300 ng DNA、1.5μL EcoRI、1.5μL HpaII或1.5μL MspI （HpaII）；连接体系（25μL）：15μL酶切产物、1μL EcoRI adaptor、1μL HpaII/MspI adaptor、0.2μL T4连接酶；预扩增体系（25μL）：连接产物1μL、rTaq酶1 U、引物分别1.5μL、dNTP 2μL；选择性扩增体系（25μL）：预扩产物稀释50倍、rTaq酶1 U、引物1.5μL、dNTP 3μL，并运用优化后的体系，终从川牛膝MSAP的256对引物中筛选出有效引物6对。结论：优化后的体系保证了稳定的图谱、清晰的条带，筛选出的6对引物组合特异性好，能够用于后续川牛膝DNA甲基化相关实验研究，同时，为其他药用植物MSAP分析提供了参考。
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桔梗同源四倍体诱导及其基因组DNA甲基化差异分析
为探究桔梗同源四倍体与二倍体试管苗外观形态差异的表观遗传变化,先将桔梗二倍体不定芽用不同浓度的秋水仙素(加0.02 g·mL-1二甲亚砜)混合液浸泡后进行组织培养,并通过流式细胞仪和根尖染色体鉴定相结合的方法鉴定倍性.在获得桔梗同源四倍体的基础上,采用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术探究二倍体与四倍体植株之间的DNA甲基化水平及其模式变化.结果表明0.2％的秋水仙素(加0.02 g·mL-1二甲亚砜)混合液处理桔梗不定芽12 h是诱导桔梗同源四倍体的适条件,其诱导率达到32.0％;四倍体与二倍体植株在外观形态上存在明显差异,经过DNA甲基化差异分析,20对引物扩增的1 586条带中二倍体有764条,四倍体有822条.二倍体总甲基化率、全甲基化率和半甲基化率分别为92.15％,61.52％,30.65％,而四倍体为86.13％,54.38％,31.75％,与二倍体相比,其同源四倍体总甲基化率降低6.02％,全甲基化率降低7.14％,而半甲基化率升高1.6％,说明染色体加倍后其DNA表观遗传模式发生了变化.
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三叶木通MSAP反应体系的优化及引物筛选
目的 研究三叶木通表观遗传多样性,建立并优化三叶木通甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)反应体系.方法 以三叶木通叶片为材料,利用正交试验建立三叶木通MSAP的预扩增和选择性扩增的佳反应体系.结果 建立的MSAP佳反应体系为酶切反应;Hpall/Mspl 10 U,EcoR I 10 U;预扩增反应;总体积20 μL,连接产物2μL,E00、HM00各125 ng,dNTPs 0.312 5 mmol/L,Mg2+ 1.875 mmol/L,Taq DNA聚合酶2U;选择性扩增反应;总体积20 μL,稀释200倍的预扩增产物5μL,引物E-ACT、HM-CAT各50 ng,dNTPs 0.250 mmol/L,Mg2+ 1.250mmol/L,Taq DNA酶1 U.利用优化的体系,终从MSAP的80对引物中筛选出有效引物6对.结论 建立的MSAP反应体系可用于后续三叶木通DNA甲基化的相关研究.
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丹参DNA甲基化MSAP分析条件的建立和优化
以丹参叶片为材料,利用MSAP技术检测丹参基因组DNA甲基化差异,对MSAP体系中的预扩增、选择性扩增体系及电泳时间进行了优化.结果表明MSAP佳反应体系为酶切反应:HpaⅡ/MspI 10U,EcoR I 10 U;佳预扩增体系为25μL反应体系中,含rTaq酶0.2μL、Mg2+ 2.0μL、模板DNA 2.0μL、dNTPs 2.0μL和上下游引物E00/HM00各1.5μL;佳选择性扩增体系为25μL体系中,含rTaq酶0.2μL、Mg2+ 2.0μL、预扩增稀释100倍产物2.0μL、dNTPs 2.0μL和上下游引物各1.0μL;佳电泳时间为5h.该检测方法方便快捷,为进一步深入研究分析丹参DNA甲基化地域差异奠定了基础.
