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蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化
目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序；筛选适合的引物,并确定佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察；采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.
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传统中药金钱草ISSR-PCR反应体系的正交优化研究
建立稳定、可靠的金钱草ISSR-PCR反应体系,为金钱草遗传多样性分析、优良品种选育、药材分子鉴定奠定基础.该研究在7水平单因素实验的基础上,采用L16(45)正交试验设计,应用SPSS 19.0进行方差分析,对影响反应体系的5个主要因素在4个水平上进行优化.利用优化的反应体系,筛选引物适退火温度,以23份不同产地金钱草材料检测体系稳定性.结果显示模板DNA,引物,dNTP,Mg2,Taq酶5个因素对金钱草ISSR-PCR反应结果均有极显著影响,影响大小依次为引物＞ Taq酶＞模板DNA＞ Mg2+＞ dNTP,确定优反应体系为总体积25μL,模板DNA 60 ng,引物0.3μmol·L-1,dNTP 0.2mmol·L-1,Mg2+1.8 mmol·L-1,Taq酶1.25 U.经不同产地样品检测,该优化体系稳定、可靠.该研究为其他物种ISSR-PCR体系的优化提供参考.
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正交设计优化地枫皮ISSR-PCR反应体系
目的 建立稳定性高、重现性好,适合地枫皮遗传差异分析的ISSR-PCR反应体系.方法 利用正交试验设计,对地枫皮ISSR-PCR反应的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA浓度)进行优化,PCR结果用SPSS统计软件分析,在此基础上对PCR反应过程中的退火温度和循环次数进行梯度检测.结果 大部分因素的不同水平对PCR反应有显著影响,其中Taq酶影响大；地枫皮ISSR-PCR佳反应体系(20 μL)为:Mg2+ 1.60 mmol/L、dNTP 0.22 mmol/L、引物0.90 μmol/L、Taq酶0.50 U、模板DNA 70.00 ng;佳退火温度和循环次数分别为51.8℃和40次；从62条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 建立的地枫皮ISSR-PCR反应体系,经过16份地枫皮样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于地枫皮遗传差异分析.
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内蒙古道地黄芪种质资源遗传多样性分析
目的 建立黄芪ISSR分析佳反应体系,并分析内蒙古地区黄芪遗传多样性.方法 采用单因素梯度浓度实验和正交试验相结合的优化方法建立稳定、可靠的ISSR反应体系;对内蒙古9个盟市30个不同居群的黄芪样本进行遗传多样性分析,用NTSYS2.1软件进行数据统计.结果 ISSR-PCR佳反应体系(20 μL):10×PCR缓冲液2.0μL、MgCl2 1.5mmol/L、dNTP 0.4 mmol/L、引物0.5μmol/L、TaqDNA聚合酶1.5U、模板DNA 40 ng;15条ISSR引物共检测到169个扩增位点,多态性位点157个,多态位点百分率为75％～100％,遗传距离变幅范围0.242 7～0.730 8,聚类分析可知,30个居群黄芪样本可分为2大类,大多数呈现地域分布规律.结论 建立的黄芪ISSR-PCR反应体系稳定可靠;内蒙古地区黄芪具有较高的遗传多样性,种质间的亲缘关系与地理位置具有一定的关系.
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正交实验设计优化白木香ISSR-PCR反应体系的研究
利用正交实验设计的方法,对白木香ISSR-PCR(简单重复序列区间-多聚酶链式反应)反应体系中的5种主要因素(dNTP、Mg2+、模板DNA、引物和Taq酶)在4个水平上进行优化筛选,建立了白木香ISSR-PCR反应的佳体系(25μ1)为:dNTP 0.2 mmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、引物0.5μmol/L、模板DNA 100 ng和Taq酶1.0 U.通过梯度PCR反应得到相应引物的佳退火温度为49.2℃.这一体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究白木香的遗传多样性提供了标准化程序.
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ISSR-PCR对我国旋毛虫7个地理株的分子鉴定
目的 探讨对不同种和地理株旋毛虫进行分子鉴定.方法 利用简单重复序列区间-PCR(inter simple sequence repeat-PCR,ISSR-PCR)标准引物对5种旋毛虫及我国旋毛虫7个地理株基因组DNA进行扩增,并观察影响扩增效果的因素.结果 5种旋毛虫均分别扩增出了各自的特异性条带:旋毛虫(T1)2条(950bp和850bp),乡土旋毛虫(T2)1条(850bp),布氏旋毛虫(T3)3条(1 300bp、950bp和700bp),伪旋毛虫(T4)1条(600bp),纳氏旋毛虫(T7)有4条带(1 700bp、1 450bp、1 050bp、900bp).我国有6个猪源旋毛虫地理株均扩增出了与T1相同的2个特异性条带(950bp、850bp).此外,T1、河南株、云南株、哈尔滨株、黑龙江同江株还扩增出了另外2条弱带(500bp和400bp);但湖北株和天津株则无这2条弱带,湖北株扩增出了1 350bp的条带,天津株扩增出了1 600bp的条带.非猪源的广西株与T1相比,缺少950bp的条带.对1条旋毛虫肌幼虫,在80%酒精保存24w的肌幼虫,在10%甲醛、0.2%叠氮钠及0.05%柳硫汞溶液保存9 w的肌幼虫,应用ISSR-PCR均可扩增出其特异性条带.结论 ISSR-PCR 用于旋毛虫种的分子鉴定具有良好的稳定性和敏感性;我国6个猪源旋毛虫地理株均为T1,其中云南株、河南株、哈尔滨株及黑龙江同江株可归为一类,湖北株和天津株可归为另一类,来自果子狸的广西株分类地位待定.
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药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化
目的 优选胡黄连稳定的ISSR-PCR反应体系.方法 采用4因素(dNTPs、Mg2+、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25 μl的ISSR-PCR反应体系中各因素佳浓度分别为10×buffer2.5 μl,dNTPS150 μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1U,引物0.5μmol/L,DNA20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs150 μmol/L,Mg2+2 mmol/L,Taq酶0.5U,引物0.5 μmol/L,DNA20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-PCR实验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.
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药用植物胡黄连ISSR-PCR反应体系的建立与优化
目的 优选胡黄连稳定的ISSR-RCR反应体系.方法 采用4因素(dNTRs、Mg~(2+)、Taq酶、引物)4水平的正交实验和单因子梯度优化相结合的方法.结果 适于胡黄连的25μl ISSR-PCR反应体系中各因素佳浓度分别为10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)1.5mmol/L,Taq酶1U,引物0.5 μmol/L,DNA 20 ng或10×buffer 2.5 μl,dNTPs 150μmol/L,Mg~(2+)2 mmol/L,Taq酶0.5 U,引物0.4 μmol/L,DNA 20 ng.结论 对于胡黄连ISSR-RCR试验,一次正交实验完全可以建立起满足要求的PCR体系.
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柴胡ISSR-PCR反应体系的建立与优化
目的 建立适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系;筛选适宜引物,并确定佳退火温度.方法 CTAB法提取叶片DNA,通过单因子实验分别找出合适的ISSR-PCR反应条件,利用梯度PGR确定引物佳退火温度.结果 适于柴胡ISSR分析的PCR反应体系为25μl总体积中含有1×taq酶缓冲液,2.0 mmol/L MgCl2,各0.15 mmol/L的dNTPs.0.3 μmol/L引物,1.5 U Taq酶(上海生工),20 ng模板DNA,2%去离子甲酰胺.在100条引物中筛选出30条扩增条带清晰且条带数目较多的引物,佳退火温度为49.9～63.6℃(因引物不同而异).结论 建立了柴胡ISSR-PCR反应体系,筛选出30条引物并确定了佳退火温度,为应用ISSR技术鉴定柴胡种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础.
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水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选
目的 优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物.方法 采用L16(45)正交设计方法,以TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg2+浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSR-PCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证.采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定佳退火温度.结果 终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR佳反应体系,即包含TaqDNA聚合酶0.7U、dNTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg2 1.5mmol/L.在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定佳退火温度.结论 经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定.
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桔梗ISSR反应体系的建立和优化
目的 建立并优化桔梗ISSR-PCR反应体系和扩增程序.方法 采用正交试验和单因子试验,对ISSR反应体系主要因子(dNTPs、Taq酶、引物、Mg2+、模板)进行筛选.之后通过单因子试验,进行引物退火温度、循环次数的筛选.结果 桔梗ISSR-PCR的佳反应体系(20μl)为:dNTPs 0.25mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.30μmol/L、Mg2+ 1.50mmol/L、模板DNA10ng.利用此反应体系从54条引物中筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,确定了引物UBC853[序列为(TC)8RC]的佳退火温度为55℃和循环次数为45次.结论 建立的桔梗ISSR-PCR反应体系,经过白、紫花桔梗共20份样品检验,证明该体系具有稳定性和可靠性,可用于桔梗遗传多样性研究.
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拳卷地钱基因组DNA提取及ISSR-PCR扩增体系优化
目的 建立一种拳卷地钱基因组DNA的提取方法;对影响拳卷地钱ISSR-PCR反应的各因素进行优化,建立稳定的反应体系.方法 采用改进的CTAB法提取拳卷地钱基因组DNA;以Taq酶、Mg2+、dNTP和引物4因素3水平的正交设计对拳卷地钱ISSR-PCR反应体系进行优化.结果 采用改进的CTAB法提取的拳卷地钱基因组DNA质量高,且适用于ISSR-PCR扩增;获得拳卷地钱佳反应体系(20μl)为:Taq酶0.5U,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP 250 μmol/L,模板DNA 50ng,引物0.6μmol/L.结论 建立并优化了拳卷地钱总DNA提取方法及ISSR-PCR反应体系.
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云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化
目的 建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物.方法 利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测佳退火温度.结果 首次建立了云南沉香ISSR-PCR的佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+ 3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、dNTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的佳退火温度为53.0℃.并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.结论 优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础.
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ISSR-PCR反应条件优化文献的计量学分析
目的 探索ISSR-PCR反应的优化结果和优化方法.方法 检索国内期刊公开发表的关于ISSR-PCR反应条件优化的文献,对文献涉及的发表年限、研究物种、试验设计方法、PCR反应成分及反应程序的优化结果进行计量学分析.结果 纳入文献383篇,研究物种和试验设计方法多样,各物种间优化结果无统计学差异.结论 需进一步改进优化方法,且可能存在普适的ISSR-PCR反应条件.
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粗茎秦艽ISSR-PCR反应体系的优化
目的:建立粗茎秦艽Gentiana crassictmlis Duthie ex Bark的ISSR-PCR佳反应体系.方法:基因组DNA为模板,分别对体系各因子进行考察.结果:佳体系为:总体积10μL,其中含0.5-1.5ng/μL DNA模板,10×Buffer缓冲液1μL,2.5mmol/L Mg++,0.5U Taq DNA聚合酶,0.6μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs.反应程序:94℃预变性5min;之后,94℃变性30s,540C℃性45s,72℃延伸90s,共38个循环;循环结束后72℃延伸7min.结论:该体系可用于粗茎秦艽种下及种间遗传变异分析及药材道地性研究.
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利用ISSR-PCR研究麻花秦艽超低温再生植株遗传稳定性
目的:建立麻花秦艽的ISSR-PCR佳反应体系,筛选适宜引物,对麻花秦艽超低温再生植株进行遗传稳定性研究.方法:试剂盒法提取麻花秦艽超低温再生植株DNA,正交设计法筛选佳ISSR-PCR反应体系,分析其遗传稳定性.结果:建立了麻花秦艽的ISSR-PCR反应佳体系(25μL):dNTPs 0.50 μL、Mg2+ 1.00 μL、10×PCR Buffer 2.00 μL、引物0.60 μL、Taq酶1.25 μL、模板DNA 1.30 μL、ddH2O 18.35 μL.扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性30 s,(根据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存.麻花秦艽超低温再生植株的变异率为1.05％.结论:超低温保存获得的麻花秦艽再生植株株间变异率较低,具有较高的遗传稳定性,可以作为麻花秦艽资源保护的一种可行方法.
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当归试管苗ISSR-PCR体系建立及遗传稳定性研究
目的:建立当归试管苗ISSR-PCR反应体系,在此基础上对当归试管苗进行遗传稳定性研究.方法:试剂盒法提取当归试管苗DNA,采用正交试验筛选佳ISSR-PCR反应条件,利用已建立的ISSR-PCR反应体系分析当归试管苗的遗传稳定性.结果:建立了当归试管苗ISSR-PCR反应的佳体系(25μL):dNTPs 1.20 μL、Mg2+0.9μL、引物1.0 μL、模板DNA 1.70 μL、Taq酶0.60μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、ddH2O17.1μL.结果表明,当归试管苗的DNA条带变异率为0.662％.结论:建立的ISSR-PCR技术体系可用于当归种质资源鉴定,当归试管苗具有很高的遗传稳定性,可作为种苗在生产上使用.
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金槐ISSR-PCR反应体系的优化研究
目的:优化金槐快速品种鉴定的ISSR-PCR反应体系.方法:选用UBC840[(GA)8YT]和UBC843[(CT)8RA]2套引物,比较ISSR-PCR传统扩增方法和PCR Master MIX扩增方法在鉴定金槐品种的应用效果.结果:与常规PCR扩增方法相比,采用PCR Master MIX进行金槐DNA-PCR扩增效果稳定,分析结果更加可靠,扩增效率高.结论:采用PCR Master MIX进行金槐DNA-PCR扩增的方法可做为金槐品种快速鉴定的一种分子标记技术.
关键词： 金槐 ISSR-PCR PCR Master MIX -
大黄ISSR-PCR反应体系的建立与优化
采用正交设计和单因素试验相结合的方法对影响大黄ISSR-PCR反应体系的重要因素(Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、DNA模板)进行优化,通过统计软件分析和直观分析获得佳的反应体系:DNA模板30 ng,2.5 μL 10×Taq Buffer,dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.25 μmol/L、Mg2+ 2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1.25 U.
