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基于随机扩增多态性DNA分析的霍乱弧菌分子分型方法的建立
目的 建立基于随机扩增多态性DNA分析(Randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)的霍乱弧菌简便快速分子分型方法.方法 选择16株霍乱弧菌代表性菌株,包括O1群、O139群和非O1/非O139群等血清群,通过40条随机引物的RAPD-PCR实验,筛选出理想的随机引物,要求其产生的DNA指纹图谱多态性高,并有足够的分辨力进行分子分型.结果 通过一系列RAPD-PCR实验和统计学聚类分析,从40条随机引物中筛选出2条符合要求的引物.16株霍乱弧菌的分析结果显示,2条引物对于O1群和O139群产毒株、O1群非产毒株和非O1/非O139群均有很好的聚类分辨率.结论 本研究筛选获得了2条随机引物并建立了基于RAPD的分子分型方法,该方法简便、省时、省力,适用于地方疾控部门和口岸检疫部门的基层实验室开展霍乱监测和流行病学溯源工作.
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随机引物在黄热病毒核酸检测中的应用
目的 将随机引物应用于黄热病毒核酸检测,为口岸快速准确地检测黄热病毒提供技术支持.方法 采用随机引物和特异性引物进行逆转录,分别用自行设计的引物、探针和参考文献的引物、探针,用实时荧光PCR方法对6份黄热病毒阳性尿液样本进行黄热病毒核酸检测,并对检测结果进行比较.结果 与特异性引物逆转录相比,随机引物逆转录的实时荧光PCR Ct值差别不显著(F值=0.11,P>0.05).结论 随机引物可直接应用于黄热病毒检测,也可在口岸传染病监测中发挥其他作用.
关键词: 黄热病毒 随机引物 实时荧光RT-PCR -
随机引物PCR方法在霍乱弧菌基因型分析中的应用
随着分子生物学的迅速发展,霍乱弧菌的检测和基因分型出现了更加快速、有效的手段.随机引物PCR又称随机扩增多态性DNA(RAPD)是在PCR的基础上发展起来的一种实验技术.
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用随意扩增多态性DNA PCR方法检查实验小鼠的嗜肺性巴氏杆菌
嗜肺性巴氏杆菌是动物致病菌,人感染多通过猫、狗咬伤或抓伤而致.嗜肺性巴氏杆菌是实验啮齿动物(特别是小、大鼠和豚鼠)巴氏杆菌病的主要病原菌.为了鉴定从实验小鼠分离的15株嗜肺性巴氏杆菌的基因型,本文用3个随机引物(每个引物不得由0个碱基组成),用RAPD-PCR方法对分离的15株嗜肺性巴氏杆菌进行扩增试验,以鉴定这15株嗜肺性巴氏杆菌的基因分型.本试验所用的15份测试菌株标本采自小白鼠,编号1~15号.24?h培养物离心沉淀,收集嗜肺性巴氏杆菌,细菌用PBS洗2次,再用单蒸水洗1次,沉淀物加0.7ml无菌水悬起,样品于100℃温度下加热煮沸5?min,迅速放冰水中冷却,直接用于PCR扩增,毋须提取DNA.3个随机引物的名称及碱基序列如下:OPL-7 5′AGG CGG GAA C-3′;ORL-11 5′ ACG ATG AGC C-3′;OPL-12 5′GGG CGG TAC C-3′,每次反应只用1个引物(图1).
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8种细菌随机扩增多态性DNA引物筛选与反应体系优化
随机扩增多态性DNA(RAPD)是一种新兴的基因分型方法,可对细菌等病原微生物进行基因分型并广泛应用于分子微生物学的追踪调查及医院感染的分析[1].该方法的大特点是可对模板序列未知,而随机引物可以是任意10个bp的单链寡聚核苷酸片段.本研究以临床常见的8种细菌为对象,各筛选200条随机引物,并应用反应曲面设计(RSD)方案[2]对反应体系中关键反应成分(模板、引物及镁离子)浓度进行了优化,旨在为相关细菌的RAPD反应体系标准化及分型提供科学依据.
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一次腹泻病原菌的随机扩增多态DNA特征
RAPD(随机扩增多态DNA)分析细菌基因组结构的突出优势是无须知道待测细菌的遗传背景,技术成熟简便,从扩增产物可以比较不同属、种、型及株系间的DNA指纹特征.1998年6~10月,呼和浩特地区发生小儿急性肠炎,为进一步认识腹泻的病原菌,对保存菌株进行了RAPD分析.一、材料与方法12株福氏志贺菌2a型、2株福氏志贺菌6型和5株奇异变形杆菌进行细菌基因组DNA的RAPD分析.随机引物选择CyberSyn生物工程公司的CY10系列套式引物,PCR扩增在PE 480型上进行.收集生长对数期菌体,0.9% NS洗涤2次,15 000 r/min离心5 min,用EB平板测定DNA含量,稀释至4 ng/ml.25 μl常规反应体系,40个循环,退火温度根据引物的不同选择从37℃到40℃.1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照记录.
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基质金属蛋白酶2、9及基质金属蛋白酶组织抑制因子1在肺间质纤维化实验中的表达
细胞外基质(ECM)合成和降解失衡是引起ECM积聚导致肺间质纤维化的重要病理生理因素。基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)是调节ECM降解的重要体系。我们以博莱霉素诱导的肺间质纤维化大鼠为模型,观察肺间质纤维化发生过程中基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、 MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP-1)基因表达的变化,探讨MMP-2、9和TIMP-1在肺间质纤维化发病中的作用。 材料与方法 (1) 动物模型制备:雌性Wistar大鼠60只(沈阳军区医学专科学校动物实验中心提供),体重(215±20)g,随机分为:模型组、对照组,每组各30只。模型组吸入乙醚麻醉后,颈前暴露气管,一次性气管内注入0.4%博莱霉素A5(天津华北制药厂)生理盐水注射液(5 mg/kg),制成动物模型。然后分别于第1、3、7、14、28天处死6只大鼠,心脏取血。对照组同样方法注入等量生理盐水,同样天数各处死6只。(2)酶谱分析:根据刘煜等[1]介绍的方法,对标本进行MMPs酶谱分析。(3) Northern Blot:取5 μg大鼠肺组织总RNA,行RT-PCR,引物序列为:MMP-2:5′-AGTGGGACA AGAATCAGATCACAT-3′(上游), 5′-TCGGTGGTACAGCTGT TGTAAGAG(下游);MMP-9:5′-AAGCAGACATTGTCAT CCAGTTTG-3(上游),5′-GACAGAAACCCCACTTCTTGTCAG-3′(下游);TIMP-1:5′-CTCATCGCGGGCCGTTTAAG-3(上游),5′-GAAGGCTTCGGGTCATCGAG-3′(下游),geneclean纯化回收PCR产物制备探针,随机引物法行α-32P-dCTP标记。20 μg RNA 样品经甲醛变性电泳、转入尼龙膜、65 ℃预杂交1~3 h、65 ℃杂交18 h,常规洗膜及放射自显影。
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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mRNA差异显示技术的应用与改进
目的:克隆和研究高低分化胆管癌间差异表达基因.方法:对mRNA差异显示PCR(DDRT-PCR)的一系列条件进行了探索和改进,建立了有效的DDRT-PCR法.结果:在高、低分化胆管癌差异分化基因的研究方面获得了满意的结果,共获得 9 个有显著差异的cDNA片段,测序后进行同源序列比较,有一个与层粘连蛋白受体基因高度同源,还有一个可能是一个新基因的部分序列.结论:通过对传统方法的改进,大大提高了工作效率,降低了实验成本和工作量并对相关问题进行了探讨,为进一步的研究奠定了基础.
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随机引物PCR基因分型方法及其在MRSA医院感染研究中的应用进展
目前MRSA、HBV、HIV三种病原所致疾病被认为是人类的三大流行传染病.自60年代发现MRSA以来,其导致医院感染所占的比例逐年上升,在革兰阳性菌中其发生率仅次于凝固酶阴性葡萄球菌[1].为了控制MRSA感染,首先要对其菌株分型,以便了解其传染源及传播途径,从而采取合理的措施防止流行和暴发感染.
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随机扩增多态DNA分析技术及其在寄生虫学中的应用
随机扩增多态DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)分析技术,又称为任意引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR),是90年代Williams和Welsh等几乎同时发明的将随机引物与PCR技术结合,对复杂基因组DNA分子多态性分析一种技术.
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地高辛标记的cDNA探针检测 IL-6mRNA表达的方法
IL-6(interleukin-6)是一种由多种细胞分泌的细胞因子,在血液病及心、脑疾病时有异常表达.IL-6被认为是目前治疗各种血小板减少症的佳药物,在治疗白细胞减少症及抗白血病、抑制肿瘤转移及骨髓移植方面也有重要作用.迄今,IL-6的检测多采用以细胞培养为基础的生物学活性检测,该方法不仅难以反映IL-6基因转录水平,而且特异性和灵敏度均受到限制.本文采用随机引物法对人IL-6cDNA探针进行地高辛标记,核酸分子原位杂交技术,建立了在转录水平上直观检测IL-6mRNA表达的实验技术,为研究IL-6的基因表达与调控奠定了基础.
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新疆地区许兰毛癣菌的PCR-RAPD分子分型研究
为了研究新疆地区许兰毛癣菌的分子分型,采用随机引物UBC 701,R-ATGS和OPAOR-15结合PCR-RAPD法对分离于新疆儿童头癣的7株许兰毛癣菌进行分子分型,并与日本的3株许兰毛癣菌做比较.初步探讨新疆许兰毛癣菌的分子分型.
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荧光实时定量RT-PCR观察伤寒杆菌鞭毛z66和d/j抗原基因表达方法的建立
目的:构建荧光实时定量RT-PCR测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d/j 编码基因mRNA的方法.方法:根据伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d/j编码基因序列,设计引物扩增其读码框架内片段,克隆进pGEM-T Easy 质粒.质粒经PCR鉴定后,纯化并定量,作为荧光实时定量PCR的标准品,并制作标准曲线.利用不同渗透压下的鞭毛素基因表达差异,比较三种随机引物(6、8、10核苷酸)与特异性引物的逆转录效果,以确定一种佳的随机引物用于多基因表达观察.结果:标准曲线有较好的线性(r=0.999),cDNA和标准品的PCR产物溶解曲线峰值一致.用8核苷酸随机引物进行逆转录的敏感度高于6、10核苷酸随机引物,低于特异性引物,但用其观测z66抗原基因和d/j抗原基因在高、低渗时表达变化趋势与用特异性引物测得结果一致.结论:成功构建用8核苷酸随机引物进行逆转录同时测定伤寒杆菌鞭毛抗原z66和d/j 基因表达的荧光实时定量RT-PCR方法.
关键词: 实时荧光定量RT-PCR 伤寒杆菌 随机引物 -
贝母类药材随机引物扩增多态性分析研究
目的 探讨贝母类药材不同居群间遗传变异大小,为贝母的种质鉴定及遗传多样性分析提供依据.方法 运用随机扩增多态性DNA技术,对浙江象山、浙江磐安、吉林通化、新疆伊犁四个不同居群贝母的基因组DNA进行随机扩增,利用NTsys2.10e软件计算遗传相似性,运用UPGMA法进行聚类分析并构建树状图.结果 共筛选了70个随机引物,从中挑选出13条多态性强、重复性好的引物,总共检测出152个位点,多态性位点96个,多态位点比率为63.2%,UPGMA聚类可以将不同来源的贝母很好地区分开来.结论 不同居群间的贝母遗传差异与地域差异有明显关系,RAPD分子标记方法可以用来鉴定不同产地的贝母.
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PCR在变形链球菌基因分型中的初步应用
目的 探索利用PCR法来对变形链球菌进行基因分型.方法:采用两组针对变形链球菌的随机引物,于不同的反应体系中,研究不同条件下进行聚合酶链反应的结果,寻找满意的聚合酶链反应条件.并对变形链球菌群(血清型 c、e、f、d、g)及3个临床分离株进行PCR扩增,对变形链球菌的电泳图谱进行分析,鉴定其基因型的多态性.结果 运用两组随机引物均可鉴别不同血清型的变形链球菌,对同一血清型的链球菌还可鉴别其不同的基因型.结论 两组随机引物均能对变形链球菌进行基因分型.随机引物PCR法简便、快速、分辨率较高,是鉴定变形链球菌基目型的有效方法.
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云南白纹伊蚊盖塔病毒的分离鉴定
目的:对我国云南省边境线获得的未知病毒进行分离鉴定.方法:将样本进行随机聚合酶链式反应,纯化链接到载体中进行序列的测定,确定病毒为甲病毒属类盖他病毒,然后用特异性引物进行衣壳蛋白基因和3'UTR区序列进行DNA测序,分析比较该病毒的分子生物学遗传特征,绘制系统发育树.结果:该病毒为盖塔病毒.结论:该病毒与韩国分离株和河北两株亲缘关系较近,而与MM2021马来西亚原始毒株亲缘关系较远.
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随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA的研究
在电镜下观察鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒时,另看到一大小为70~80nm,无囊膜,20面体对称的病毒颗粒.为了解该污染病毒,作者挑选了4条随机引物对此未知病毒分别进行反转录PCR和直接PCR扩增,结果共扩增出3条基因片段,经测序(一个反应)后分析与禽腺病毒1型--鸡胚致死孤儿病毒基因组部分序列同源性分别高达99.5%、99.6%和99.5%.从而得知鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒受到了鸡胚致死孤儿病毒的严重污染.
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随机引物PCR法在变形链球菌基因分型中的初步应用
目的:研究利用随机引物PCR法来对口腔变形链球菌进行基因分型.方法:采用两组针对变形链球菌的随机引物,于不同的反应体系中,对变形链球菌群(血清型c、e、f、d、g)及3个临床分离株进行PCR扩增,并对变形链球菌的电泳图谱进行分析,鉴定其基因型的多态性.结果:运用两组随机引物均可鉴别不同血清型的变形链球菌,对同一血清型的链球菌还可鉴别其不同的基因型.结论:两组随机引物均能对变形链球菌进行基因分型.随机引物PCR法简便、快速、分辨率较高,是鉴定变形链球菌基因型的有效方法.
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两种药用石斛RAPD反应的实验简报
从20种随机引物中筛选出:对美花石斛(Dendrobium loddigesii)和束花石斛(D.chrysanthum)扩增具有较明显多态性的3种引物,其中S12扩增差异性为显著.