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NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达及其与淋巴结转移的关系
NDRG1基因(N-myc downstream regulated gene 1)是1997年由van Belzen等[1]用差异显示法从结肠癌细胞系HT-29中首先发现和分离的.Guan等[2]在8个结肠癌细胞系和10个结肠癌组织样本中研究了该基因与肿瘤转移的关系,提出该基因可作为一个候选的肿瘤转移抑制基因.我们采用免疫组织化学、原位杂交技术,观察NDRG1基因在结直肠癌发生发展过程中的表达特点,探讨其与结直肠癌转移的关系.
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不同分化胆管癌差异表达基因的分离、克隆和功能研究
从分子水平研究胆管癌发病机理及病理过程,对认识及防治胆管癌都具有重要的理论和实际意义.基于临床研究的结果[1],我们采用Liang 1992年建立的差异显示法(DDRT-PCR)[2],来寻找高、低分化胆管癌间差异表达基因的cDNA.1.材料和方法:(1)采用TRIzol总RNA提取试剂盒,分别提取高分化、低分化胆管癌新鲜组织总RNA,逆转录合成单链cDNA.(2)DDRT-PCR:在20 μL体系中对2 μL逆转录产物进行扩增,加入2 μmol/L 4dNTPs, 5 μmol/L 锚定引物T15M, 1 μmol/L随机引物, 37Bqα-32P-dCTP,1.5UTaq酶.(3)DD-PCR产物取6 μL上样于6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒定功率50W,电泳约3 h,滤纸揭胶,覆保鲜膜后压X光片,-70 ℃曝光14 h,显影.确定感兴趣的差异片段的位置并切胶,将切下的凝胶常规方法提纯并进行再扩增.(4)反向Northernblot鉴定:点样后,用化学变性及热变性法交联,标记探针基本上按照文献[3]进行.常规方法68℃杂交12 h,中等强度洗膜后放射自显影,-80 ℃压片22 h,显影.(5)PCR产物经纯化后可以直接用来测序,测序引物用T15N,PCR产物的核苷酸序列分析采用全自动DNA序列分析仪及配套的ABI试剂.
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应用RACE技术获取小鼠乳腺癌转移相关基因 G15γ5′端未知序列(论著摘要)
G15γ5′是本组以往用mRNA差异显示法从γ干扰素预处理的小鼠腺癌细胞系MA891中分离出的cDNA片段,推测其代表的基因可能与肿瘤转移有关.为进一步研究其功能,采用cDNA未端快速扩增技术(RACE),以获取该片段5′端未知序列.用IFN-γ(200 U/ml)处理MA891细胞48 h,提取总RNA并用DNaseI纯化.根据G15γ5′端序列,设计合成3个基因特异性引物GSP1,GSP2和GSP3.以GSP1为引物合成cDNA第1链,用末端转移酶在cDNA第1链的3′端进行同聚物加尾,对加尾后的cDNA先后用GSP2和GSP3与锚定引物进行初级及巢式PCR扩增,终得到一552 bp的扩增产物并将其克隆至pCRTM Ⅱ载体,经Northern印迹分析及序列分析证实,所得片段确实是G15γ5′的5′端延续.
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肿瘤浸润性淋巴细胞的Caltractin 基因过表达
[目的]发现新的肿瘤相关基因,并确定肿瘤组织细胞Caltractin基因的表达状况.[方法 ]用荧光差异显示法对2例乳腺癌的基因表达进行分析,锁定呈高表达的Caltractin基因. 用Northern印迹杂交法测定Caltractin基因在10例恶性肿瘤(乳腺癌5例、肝癌1例、胃癌3 例及胃平滑肌肉瘤1例)中的表达.而用原位杂交法检测Caltractin基因在乳腺癌2例及胃癌 2例表达的细胞类型.[结果]荧光差异法显示Caltractin基因在乳腺癌组织中呈现过表达.Northern印迹杂交检测显示在10例恶性肿瘤中均出现Caltractin基因的过表达.原位杂交法示肿瘤浸润性淋巴细胞出现Caltractin mRNA信号.[结论] Caltractin基因在肿瘤浸润性淋巴细胞中呈过表达.
关键词: Caltractin基因 肿瘤浸润性淋巴细胞 差异显示法 原位杂交 -
010利用差异显示法获取约氏疟原虫感染肝期特异性表达基因
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差异显示法证实氧化型低密度脂蛋白刺激血管内皮细胞胸腺素β4的高表达
克隆、分离在致动脉粥样硬化因素作用下血管内皮细胞基因的差异表达对了解动脉粥样硬化发生的分子机制至关重要,用改进的差异显示-多聚酶链技术分离、克隆氧化型低密度脂蛋白刺激培养的内皮细胞有差异表达的基因,用Northern印迹法证实差异表达的基因.结果发现氧化型低密度脂蛋白诱导培养的人脐静脉内皮细胞中出现一个上调节的cDNA片段,长283bp,其序列与人胸腺素β4基因有100%的同源性,具有完整的开放阅读框架.Northern印迹分析证实氧化型低密度脂蛋白诱导人脐静脉内皮细胞胸腺素β4升调了3倍.从而提示氧化型低密度脂蛋白刺激血管内皮细胞胸腺素β4的高表达,进而调节血管内皮细胞的增殖、分化.改进的差异显示-多聚酶链技术具有便捷、特异性高、重复性好的特点.