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160六价铬诱导P53蛋白活化的机制
本研究探讨了Cr(Ⅵ)诱导P53活化的机制.培养人肺上皮细胞系A549并进行传代.取3×105A549细胞转入一个6孔平皿,于37℃下温孵24h,立即转染1μg报告质粒和1μg β-半乳糖苷酶(β-Gal)质粒,温孵过夜后冲洗,加入含10%FBS的F-12K培养基,再培养24h后加入5、10、20、50和100μmol/L的Cr(Ⅵ)溶液处理(未经处理的为对照),然后加入400μl报道溶解缓冲液,在4℃下抽提细胞2h;取80μl细胞溶解产物测量虫荧光素酶和β-Gal活性,结果以β-Gal标化的相对P53活性(与对照相比)来表示.另取经Cr处理后的A549细胞,抽提细胞经声处理断裂DNA和减少粘度,然后取20μl全细胞溶解产物加热、离心,进行蛋白印迹分析(Westernblot).取细胞溶解产物、20μlRecin/TNT(1:10)和10μg抗体在4℃下温孵过夜并离心,取上清进行Western blot反应.
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小儿髓系白血病的分子遗传学改变的临床意义
白血病是儿童常见的恶性病,髓系白血病的发病数低于淋巴细胞白血病.临床分为急性髓系白血病(AML)和慢性髓系白血病(CML).白血病的基因改变已经通过细胞遗传学分析证实,然而细胞遗传学技术难于掌握,并且仅能显示大体的染色体异常,分子生物学进展所产生的一些技术,包括荧光原位杂交、DNA印迹分析和逆转录-PCR(RT-PCR).这些技术比细胞遗传学检查有更高的敏感性和特异性,可以对细胞遗传学改变不明显和不可见的亚微结构改变进行基因分析.另外,髓系白血病细胞的免疫表型在临床分型上的特异性较低,因而其分子表型的应用价值相对更大些,髓系白血病的基因标记多为染色体易位所产生的融合基因,现将研究较多者简述于下.
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在豚鼠耳蜗中磷脂酶C的不均匀性
通过印迹分析及免疫细胞化学方法,检测研究了在豚鼠耳蜗存在的磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(PLC)异构体。通过Western印迹分析,发现在耳蜗感觉上皮(CSE)中存在着PLCβ1和δ1表达,而在耳蜗侧壁中则存在着PLCβ1、γ1和δ1表达。通过CSE免疫细胞化学研究,发现PLCβ1样的免疫反应主要表达在豚鼠耳蜗外毛细胞(OHCs)中,而在内毛细胞中(IHCs)则无此反……
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RNA快速提取一步法的建立
RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分, 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示(mRNA differential display)、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交(suppression Subtraction Hybridization, SSH)、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA. 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题.1987年Chomczynski等[1]建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC).该方法较以往的传统方法操作简单,无需特殊的设备,抽提时间缩短至4 h,因而得到广泛的应用.数家公司据此开发出RNA提取试剂盒[2,3].使用试剂盒简单方便,但价格相对昂贵.为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法,我们分析了大量相关文献资料,进行了多次实验,成功地研制出一种新型的RNA提取试剂,建立了其操作程序,我们称之为RNA快速提取一步法.其性能达到进口试剂盒的水平,但造价低廉、操作简便,特别适用于国内实验室.
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应用RACE技术获取小鼠乳腺癌转移相关基因 G15γ5′端未知序列(论著摘要)
G15γ5′是本组以往用mRNA差异显示法从γ干扰素预处理的小鼠腺癌细胞系MA891中分离出的cDNA片段,推测其代表的基因可能与肿瘤转移有关.为进一步研究其功能,采用cDNA未端快速扩增技术(RACE),以获取该片段5′端未知序列.用IFN-γ(200 U/ml)处理MA891细胞48 h,提取总RNA并用DNaseI纯化.根据G15γ5′端序列,设计合成3个基因特异性引物GSP1,GSP2和GSP3.以GSP1为引物合成cDNA第1链,用末端转移酶在cDNA第1链的3′端进行同聚物加尾,对加尾后的cDNA先后用GSP2和GSP3与锚定引物进行初级及巢式PCR扩增,终得到一552 bp的扩增产物并将其克隆至pCRTM Ⅱ载体,经Northern印迹分析及序列分析证实,所得片段确实是G15γ5′的5′端延续.
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大鼠缺氧再灌注脑损伤时核因子-κB的表达
核因子κB(NF-кB)是一种广泛存在于各种细胞(包括神经元)核内的转录调节因子,在免疫、应激反应、炎症和细胞凋亡等方面具有重要作用[1].但是NF-кB的活化对神经元具有保护作用还是损伤作用并不十分清楚.本研究拟应用Western 印迹分析技术检测缺氧再灌注后大鼠脑皮质内NF-кB的表达,并通过观察其下游靶基因诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD)的变化以期阐明NF-кB在缺氧再灌注脑损伤过程中的作用.
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吲哚胺-2,3-双加氧酶在非小细胞肺癌的表达及其意义
目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织(肺癌组织及配对淋巴结转移癌组织)中吲哚胺-2,3-双加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase,INDO)的表达水平与NSCLC临床病理学参数之间的关系.方法:用免疫组织化学检测80例肺癌组织(包括原发性肺癌组织和配对淋巴结转移癌组织)、癌旁正常肺组织石蜡切片中INDO的表达水平,Western blot法检测其中40例新鲜肺癌组织及其癌旁正常肺组织中INDO的表达情况,根据手术、病理和影像学结果判断有无转移并确定分期,分析INDO蛋白表达水平与临床病理学参数之间的关系.结果:INDO蛋白阳性部位位于肺癌细胞质,其在原发性肺癌组织中阳性率为80.00%,明显高于在癌旁正常肺组织中的阳性率20.00%(P<0.001),在有淋巴结转移组中的阳性率为95.56%,显著高于在无淋巴结转移组中的阳性率60.00%(P<0.01),且与淋巴结转移有一定关系(P<0.05).淋巴结转移癌中INDO阳性表达率为97.78%,显著高于原发灶中INDO的表达率80.00%(P<0.01).结论:INDO在肺癌原发灶表达显著高于正常肺组织,且与NSCLC的淋巴结转移显著相关,而淋巴结转移癌中的表达又显著高于配对肺癌原发灶中的表达,提示INDO异常高表达可能与NSCLC转移有关.
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角膜上皮细胞Pax-6基因表达分析
目的检测体外培养角膜上皮细胞Pax-6基因的表达,探讨维持角膜缘干细胞特性的基因因素.方法地高辛标记cDNA探针进行DNA印迹杂交和蛋白质免疫印迹,检测培养的角膜上皮细胞中Pax-6基因表达状况. 结果EcoR Ⅰ酶切角膜缘上皮细胞中9.1 kbp的DNA片断与探针序列相同,其中原位和原代培养细胞、传第l代明显测出,角膜中央上皮细胞的原位和原代细胞中也能测出.Western Blot发现抗血清11认识相对分子质量为81×103和55×103两种角膜上皮细胞蛋白;抗血清13认识60×103的角膜上皮细胞蛋白,原位和原代、传第1代角膜缘干细胞和角膜中央上皮细胞均能够测出,角膜缘传第3代细胞和角膜基质细胞不表达.结论角膜缘干细胞和角膜中央上皮细胞均具有Pax-6基因,该基因的正常表达是维持角膜上皮细胞特性的必要条件.
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山莨菪碱减轻TNF-α所致内皮细胞凋亡
目的:从转录因子水平观察山莨菪碱能否减轻TNF-α所致内皮细胞的凋亡,并探讨其机制是否与其抑制NF-κB活化有关.方法:培养小牛肺动脉内皮细胞(BPAEC),将山莨菪碱(0.2 mg/mL)加入细胞培养基中,30 min后再加入TNF-α(2500 U/mL)损伤24 h,采用Hoechst 33258染色,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,并进行显微照相.采用Sellin法抽提细胞上清片段DNA及琼脂糖电泳,观察是否出现DNA梯状条带,用二苯胺法测定上清液及沉淀物中DNA含量,计算细胞DNA断裂百分率.BPAEC表达I-κBα及iNOS的Western blot印迹分析及用凝胶滞留法EMSA检测NF-κB活性.结果:山莨菪碱能明显减轻TNF-α所致的BPAEC凋亡,表现为荧光显微镜下凋亡细胞减少,未见明显梯状条带,DNA断裂百分率也明显减少.山莨菪碱抑制TNF-α所致的I-κBα的含量下降及NF-κB的活化,并抑制TNF-α所致的NF-κB从胞浆向胞核的移位.另外山莨菪碱能减少因TNF-α刺激所引起的BPAEC表达iNOS的增加.结论:山莨菪碱减轻TNF-α所致的内皮细胞凋亡,可能与山莨菪碱抑制NF-κB激活,从而抑制iNOS合成有关.
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EB病毒LMP1在鼻咽癌细胞中通过NFκB促进Igκ表达
利用已建立的受四环素调控LMP1表达的鼻咽癌细胞系,用受CMV启动子调控的NFκB报道基因质粒pNFκB-luc的荧光素酶表达分析NFκB的活性,并以核蛋白的Western印迹方法观察LMP1表达前后核内NFκB组分p65量的改变,用全蛋白Western印迹分析Igκ蛋白质的表达等方法,探讨在鼻咽癌中,EB病毒LMP1蛋白是否通过核转录因子NFκB促进免疫球蛋白κ轻链(Igκ)基因的表达.结果显示在诱导LMP1表达的状态下,NFκB活性增强,NFκB的p65蛋白呈核内聚集现象,Igκ的表达增高,而导入反义LMP1表达质粒后,NFκB活性下降,Igκ的表达减弱;加入硫代磷酸化的反义NFκB p65或p50后,Igκ表达水平下降.因此,在鼻咽癌细胞中,NFκB作为LMP1信号转导通路上的枢纽,可能介导了LMP1对Igκ的表达调控.