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妊娠晚期血凝指标表达分析及临床意义
对妊娠晚期孕妇进行血凝指标的检查及其表达的分析,对于检测孕妇血凝状况,及时检测及预防异常出血、防止并发症的发生有重要意义.1 材料与方法1.1 材料.健康对照组:健康体检者,女50例,年龄22～35岁,平均26.1±7.3岁,无出凝血疾病.病例组:60例,随机选取同期住院孕晚期妇女,年龄21～37岁,平均25.8±6.2岁.
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雷公藤单加氧酶基因全长克隆及表达分析
目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径.本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因cDNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析.方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因cDNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等.结果:根据分析结果TwMO基因全长为2193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 kDa,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性.雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,实时荧光定量结果显示,Tw-MO的表达量明显增加,并在48 h达到高,提示TwMO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关.结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.
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黄芩延长因子1a基因全长cDNA的克隆及其功能
目的:克隆黄芩延长因子1a全长cDNA序列,并分析温度对其表达水平的影响.方法:通过构建黄芩全长cDNA文库克隆黄芩延长因子1a,利用生物信息学手段分析该基因的序列特征；利用RT-PCR分析温度对黄芩延长因子1a基因表达水平的影响.结果:黄芩延长因子1a基因长1 672 bp,开放阅读框位于97～1 446,共449个氨基酸,具有典型的延长因子1a结构域；高温和低温处理后,黄芩EF1a的转录水平均显著提高.结论:黄芩EF1a的克隆为进一步研究其在黄芩生长代谢过程中的功能和作用提供了基础.
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基因芯片及其在中医药研究中的应用思考
随着人类基因组计划应运而生的生物芯片技术,正激起了生命科学研究者的广泛兴趣.生物芯片包括基因芯片(gene chip)、蛋白质芯片(protein chip)、组织芯片(tissue chip)三种.目前完善的是基因芯片,又称基因微阵列(gene microarray)、DNA芯片(DNA chip)或cDNA微矩阵(cDNA Microarray).基因芯片以其高通量、简便、缩微、多参数、集约化、平行化等优点,正成为目前基因表达分析的有力的工具.中医药学如何面对新技术,抓住机遇,促进发展,值得深思.笔者认为基因芯片的应用将为中医药现代化提供良好契机.
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白花丹参顺式还原酮加双氧酶基因的克隆、分子特征和表达调控分析
目的:获得白花丹参参与乙烯和多胺合成的顺式还原酮加双氧酶(acireductone dioxygenase,ARD)基因(命名为SmARD)序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究.方法:利用全长cDNA文库技术,从两年生白花丹参根中获得目的基因SmARD序列.利用BLAST进行序列比对,ORF Finder寻找该基因的开放读码框,prosite分析蛋白质的基本结构域.用半定量RT-PCR检测其在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花中的表达情况.结果:得到688 bp的SmARD基因全长序列.具有一个591 bp的开放读码框,编码196个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量23.27 kDa.使用预测的SmARD蛋白序列在NCBI中进行蛋白保守域分析,发现SmARD与ARD/ARD'家族具有很高的同源性.半定量RT-PCR表明,SmARD在白花丹参幼苗根、茎、叶和成花等组织中均有转录水平的表达,但是在根部表达强.水分亏缺处理3 d,150 mmol·L-1 NaCl处理1 d,4℃低温处理1 d和100 μmol·L-1 ABA处理1 d均抑制SmARD的表达,100 μmol·L-1茉莉酸甲脂(MJ)和10 μmol·L-1乙烯利(ETH)处理1 d诱导SmARD的表达.结论:首次得到白花丹参的顺式还原酮加双氧酶(ARD)基因序列,为其参与白花丹参响应逆境和次生代谢产物合成的信号调节功能研究奠定了基础.
关键词： 白花丹参 顺式还原酮加双氧酶(ARO)基因 序列分析 表达分析 -
地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析
为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应.以拟南芥At IAA 14的cDNA序列为探针在地黄转录组数据库中进行比对,应用生物信息学方法分析RgIAA1的序列特征及进化关系,以实时荧光定量PCR技术检测Rg IAA1在地黄不同组织以及逆境胁迫下的表达量.结果表明,获得1条903 bp的cDNA序列,包含一个681 bp完整的开放阅读框(ORF),编码226个氨基酸,具有Aux/IAA家族蛋白的典型结构域和特征序列.RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达,其中在地黄幼嫩叶片里表达强度大,其次为茎,且随着叶片的伸展,RgIAA1表达强度不断降低.在连作时RgIAA1的表达量升高,NaCl和渍水胁迫下RgIAA1的表达量降低.实验首次克隆了地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1,为阐明其在地黄生长发育和逆境胁迫中的分子功能奠定基础.
关键词： 地黄 Aux/IAA家族基因 序列特征 表达分析 -
猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析
该研究采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到2种热激蛋白基因,其中PuH-sp90基因的开放阅读框2 091 bp,编码696个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约78.9 kDa;PuHsp70基因的开放阅读框1 944 bp,编码647个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约70.5 kDa;蛋白质结构预测及同源比对分析表明,这2个基因编码的核苷酸序分别具有Hsp90,Hsp70蛋白的保守结构域.进化树分析表明,PuHsp90与变色栓菌Hsp90聚为一类,PuHsp70与肝色牛排菌Hsp70聚为一类.qRT-PCR分析表明,蜜环菌侵染的情况下,这2个基因在猪苓菌核中均上调表达.这2个基因在蜜环菌侵染猪苓菌核的状态下有相同的表达模式,预示这2个基因其可能在抗生物胁迫中起重要作用.
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刺五加钙调蛋白基因的克隆及内生真菌对其表达的影响
目的:克隆刺五加的钙调蛋白( calmodulin,CaM)基因,并分析内生真菌对其表达的影响.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加CaM基因的全长cDNA序列.通过RT-PCR法检测可显著提高刺五加皂苷含量的内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对CaM表达的影响.结果:刺五加CaM基因的cDNA全长为856 bp,开放阅读框长450 bp,编码149个氨基酸的蛋白,与人参Panax ginseng和胡萝卜Daucus carota等物种的CaM同源性均高达100％.RT-PCR的结果显示,内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量(P＜0.05),大表达量出现在菌株P109-4回接90 d时,达对照的2.96倍.结论:首次克隆并报道了刺五加CaM的cDNA全长序列,并证实内生真菌可显著提高刺五加CaM基因的表达量,为阐明内生真菌提高刺五加三萜皂苷含量的机制奠定了基础.
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铁皮石斛转录因子基因DoWRKY1的克隆与表达分析
WRKY转录因子是植物中发现的新型转录调控因子,在调控植物生长发育和代谢等生理过程中发挥重要作用.该研究采用RT-PCR和RACE技术从铁皮石斛Dendrobium officinale中克隆得到一个新的WRKY转录因子基因cDNA全长,命名为DoWRKY1,提交GenBank获得登录号KF716131.生物信息学分析表明,该基因全长cDNA为1 704 bp,其中开放阅读框(ORF)1 629 bp,编码1条由542个氨基酸组成的多肽,具有2个WRKY保守结构域,属于WRKY家族第Ⅰ类转录因子.酵母单杂交表明,DoWRKY1可以激活下游报告基因(His3,Ade2)的表达,具有转录激活功能,属于转录激活子.半定量RT-PCR显示,DoWRKY1在根、茎、叶和类原球茎中均有表达.qRT-PCR分析表明,DoWRKY1响应茉莉酸甲酯(MeJA)和壳聚糖(chitosan)诱导,分别在2h和1h,表达量达到高峰.研究结果为进一步研究其在铁皮石斛次生代谢过程的调控功能奠定基础.
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川牛膝CoObgC基因克隆、亚细胞定立及表达分析
根据川牛膝基因组数据提供的基因序列合成特异性引物,利用常规PCR方法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆川牛膝ObgC(GeneBank登录号KU847910)全长cDNA序列,克隆获得2 226 bp全长CoObgC序列,开放阅读框为1 818 bp,编码605个氨基酸序列,预测CoObgC蛋白相对分子质量为66.39 kDa,等电点p1 5.35,为稳定蛋白,并进行多重序列比对和构建系统进化树分析.以川牛膝actin为内参,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析CoObgC基因在川牛膝根、茎、叶、花4种组织中表达特征,结果显示在叶片中表达丰度高,其次为根、花、茎;构建pCABIA2300-CoObgC重组载体,利用农杆菌介导法在烟草中进行瞬时表达,激光扫描共聚焦显微镜观察显示川牛膝CoObgC定位于叶绿体.该研究为进一步解析Obg基因的结构和功能,开展川牛膝分子生物学研究奠定基础.
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腊梅葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH1)基因的克隆及表达分析
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键限速酶.研究根据已经报道的G6PDH基因的保守序列引物扩增腊梅花中G6PDH基因的核心序列,利用RACE技术从腊梅中首次克隆得到一个G6PDH基因cDNA全长,命名为G6PDH1,并对G6PDH1蛋白质进行细胞定位预测、跨膜结构分析、三维结构模拟及聚类分析,预测G6PDH1的生物学信息;利用实时荧光定量PCR检测G6PDH1在腊梅不同组织中和冷处理条件下的表达差异分析.该研究中克隆获得的G6PDH1基因的全长为2011bp,开放阅读框1 551 bp,编码516个氨基酸.组织表达分析的结果显示,G6PDH1基因主要在花和根中表达,在叶和茎中表达量较低.通过冷处理,该基因在12 h时达到高表达水平.研究通过对腊梅花中G6PDH1基因全长cDNA克隆和表达特异性分析,为以后深入研究腊梅的抗寒机制奠定了基础.
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雷公藤4-(5'-二磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析
4-(5-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-(cytidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一.根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物,采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA,并进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测茉莉酸甲酯(MeJA)诱导雷公藤悬浮细胞后0～ 72 hTwCMK基因的表达水平.结果表明,TwCMK全长 cDNA由1 732个核苷酸组成,具有完整的开放阅读框,共编码387个氨基酸,蛋白相对分子质量为42.85 kDa,理论等电点为5.79;TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24 h时达到高值.为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础.
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樟树4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因的克隆及表达分析
4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase,CMK)是植物萜类化合物生物合成途径甲基赤藓醇-4-磷酸途径(methylerythritol-4-phosphate pathway,DXP/MEP)上的第4个关键酶.该研究根据樟树转录组数据,利用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从药用植物樟树Cinnamomum camphora中克隆得到4-二.磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶基因,命名为CcCMK1(GeneBank登录号Ku376098),对其序列进行生物信息学分析,结果表明该基因开放阅读框(ORF)为1 212 bp,编码403个氨基酸,推测其相对分子质量为44.46 kDa,等电点(theoretical pI)为4.99.跨膜结构分析表明CMK蛋白不存在跨膜结构.信号肽分析表明其为非分泌蛋白,不存在信号肽.亚细胞定位表明其定位于叶绿体中.利用荧光实时PCR检测了龙脑樟、油樟、芳樟、脑樟和异樟5种化学型樟树中CcCMK1基因的表达量,结果表明CcCMK1基因在油樟中的表达量高,龙脑樟中表达量低,为樟树萜类化合物生物合成途径关键酶基因元件挖掘提供研究基础.
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红花生育酚环化酶基因的克隆及表达分析
生育酚环化酶(tocopherol cyclase,TC)是植物Vit E生物合成途径的关键酶之一.该研究根据红花转录组数据,利用RT-PCR(reverse transcription-PCR)方法从药用植物红花种子中克隆得到生育酚环化酶基因序列,命名为CtTC,对其进行生物信息学分析,结果表明该基因开放阅读框(ORF)为1 524 bp,编码507个氨基酸,相对分子质量为62.9 kDa,等电点(theoretical pI)为5.01.跨膜结构分析表明TC存在跨膜结构.蛋白糖基化位点分析表明TC蛋白含有1个丝氨酸糖基化位点以及1个苏氨酸糖基化位点.亚细胞定位表明其定位于叶绿体中.利用荧光定量PCR检测红花不同发育时期种子以及干旱胁迫不同时间的红花叶片中TC基因的表达量,结果表明TC基因在红花的开花后50 d的种子中表达量高,干旱胁迫6d时TC基因的表达量达到高值,随后下降,为TC基因在红花Vit E合成以及抵抗逆境胁迫中的功能研究奠定基础.
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刺五加法尼基焦磷酸合酶基因的克隆、生物信息学及表达分析
目的:克隆刺五加的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因,并对其进行生物信息学和表达分析.方法:采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆刺五加FPS基因的全长cDNA序列.运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能.并通过RT-PCR法检测FPS在不同器官中的表达情况.结果:刺五加FPS基因的cDNA全长为1 499 bp,开放阅读框长1 029 bp,编码342个氨基酸的蛋白,包含2个富含天冬氨酸(DDXXD)的保守功能域.FPS蛋白无跨膜区域,定位于细胞质中.RT-PCR的结果显示,刺五加FPS基因在各器官中均有表达,但表达具有显著差异(P＜0.05).结论:首次分离并报道了刺五加FPS的cDNA克隆,并证实其在不同器官中的表达量不同,为进一步研究FPS对刺五加皂苷合成的影响和表达调控奠定了基础.
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菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT基因的克隆和表达分析
根据菘蓝转录组数据,克隆了菘蓝莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶IiHCT的全长cDNA并进行生物信息学分析,进一步利用实时荧光定量PCR技术分析了IiHCT基因的表达模式.IiHCT ORF为1 290 bp,编码430个氨基酸,等电点为5.77,相对分子质量为47.68 kDa.IiHCT主要在菘蓝茎中表达,幼根、叶、花蕾中几乎不表达.同时发现离体菘蓝毛状根中可以检测到IiHCT的表达,外源茉莉酸甲酯(MeJA)处理后,IiHCT相对表达量明显增加,在4h达到原先的4.3倍.研究首次从菘蓝中克隆得到HCT基因,为进一步解析菘蓝苯丙素类成分的生物合成途径奠定基础.
关键词： 菘蓝 莽草酸羟基肉桂酸酰转移酶 克隆 实时定量PCR 表达分析 -
内生真菌对刺五加皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响
目的:分析刺五加内生真菌菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1对刺五加中皂苷合成关键酶基因SS( squalene synthase),SE( squalene epoxidase),bAS(β-amyrin synthase)表达量和皂苷含量的影响.方法:伤口法回接内生真菌.以GAPDH为内参照基因,Real time PCR法检测关键酶基因表达量的变化.分光光度法测定刺五加的总皂苷含量.结果:回接P116-1a和P116-1b 30 d,刺五加SS基因的表达量显著提高(P＜0.05),P109-4和P312-1无显著变化,之后出现降低-相等-降低的变化趋势.回接菌株P312-1 30 d,刺五加SE的表达量显著提升(P＜0.05),回接菌株P116-1b和P312-1 90 d,SE的表达量分别显著提升至对照的130％,161％ (P ＜0.05).回接120 d,4个菌株处理的SE表达量均显著高于对照(P＜0.05).各处理bAS的表达量在回接60 ～ 120 d时均显著高于对照(P＜0.05).4个菌株均显著提高了刺五加的皂苷含量(P＜0.05).结论:菌株P116-1a,P116-1b,P109-4,P312-1可显著影响刺五加SS,SE,bAS的表达量,进而影响刺五加的皂苷含量,其中bAS为主要靶点基因.
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白木香转录因子AsMYB1和AsMYB2克隆及表达分析
MYB类转录因子是数量多、功能多样化的转录因子家族之一.该研究根据白木香转录组高通量测序结果设计引物扩增白木香中MYB基因,利用RT-PCR技术从白木香中首次克隆得到2个MYB基因cDNA 全长,分别命名为AsMYB1,AsMYB2,并对MYB蛋白质进行跨膜结构分析和聚类分析,预测其生物学信息;利用实时荧光定量PCR技术检测 AsMYB基因在不同组织, 及在NaCl、低温(4 ℃)、重金属(CdCl2)、干旱(甘露醇)4种非生物胁迫和脱落酸、水杨酸、赤霉素、茉莉酸甲酯4种外源激素处理下的表达差异.该研究中克隆获得的AsMYB1基因全长1 063 bp,编码353个氨基酸;AsMYB2基因全长1 081 bp,编码359个氨基酸.2个基因具有组织表达特异性;AsMYB1,AsMYB2 基因的转录水平受到不同生物胁迫和外源激素的影响,说明MYB基因对白木香防御反应和激素信号传导具有重要的作用.
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雷公藤MCT基因的全长克隆与表达分析
根据雷公藤转录组数据提供的基因片段设计特异引物,采用全长PCR方法克隆TwMCT全长cDNA,分析序列同源性,预测TwMCT蛋白结构,并进行序列多重比对和构建系统进化树分析;采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR),以actin为内参,分析雷公藤悬浮细胞受茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后0～ 72 hTwMCT基因的相对表达量.克隆得到全长1 318 bp TwMCT全长cDNA,具有完整编码框,编码311个氨基酸,蛋白相对分子质量为34.14 kDa,理论等电点为8.65;RT-qPCR结果表明该基因受MeJA诱导后表达逐渐上升,在24h时达到高值.克隆雷公藤TwMCT全长cDNA和分析表达特性,为进一步研究该基因的功能和雷公藤次生代谢调控提供了基因元件.
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丹参转录因子SmbHLH1基因的克隆和表达分析
目的:获得丹参转录因子SmbHLH1全长基因,分析SmbHLH1基因在丹参不同组织部位,以及不同诱导子处理后的表达差异.方法:利用RT-PCR等技术获得SmbHLH1基因全长,利用半定量RT-PCR,分析SmbHLH1基因在丹参不同部位的表达情况,及在不同处理条件下的表达情况.结果:获得的SmbHLH1基因由999个核苷酸组成,编码332个氨基酸,蛋白相对分子质量约36 kDa；半定量RT-PCR检测,该基因在丹参的根中表达量高,其次是茎,在叶和花中有微量表达；茉莉酸甲酯,以及酵母提取物和Ag+共同诱导,会抑制该基因的表达,水杨酸和脱落酸对该基因的影响不大.结论:丹参SmbHLH1基因是bHLH家族新成员,其功能可能与油菜素内酯信号途径有关.
