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代表性差异分析和消减杂交差异显示分析方法在克隆差异基因方面的灵敏度比较
目的 建立目的基因差异信息标量化的配对研究体系,比较经典的代表性差异分析(RDA)方法和消减杂交差异显示分析(SHDD)方法在克隆差异基因方面的灵敏度.方法 以人类乳头瘤病毒(HPV)DNA为模板行PCR扩增获得376 bp和869 bp两个片段.作为差异日的基因掺入人血基因组DNA,获得5组目的基因拷贝数呈梯度差异的配对研究体系,比较RDA和SHDD方法的检测灵敏度.结果 应用RDA方法可克隆得到上调6倍的376 bp片段和上调8倍的869 bp的HPV片段,而应用SHDD方法可克隆到上调4倍的两种差异片段.结论 SHDD 方法由于采用了两样本差异产物间的双向均衡消减杂交,避免了经典RDA方法不均衡消减杂交导致的差异信息的丢失,在克隆较弱的差异信息,尤其是较长差异信息方面,显著优于经典RDA 方法.
关键词: 代表性差异分析 消减杂交差异显示分析 基因组 DNA 人乳头瘤病毒 -
RNA快速提取一步法的建立
RNA是分子生物学研究的一个重要组成部分, 不论是cDNA文库的构建、RT-PCR、RNA序列分析、差异显示(mRNA differential display)、代表性差异分析 (representational Difference Analysis, RDA)、抑制性消减杂交(suppression Subtraction Hybridization, SSH)、Northern印迹分析、蛋白质的体外翻译等均依赖于高纯度完整的RNA. 因此, 如何获得高质量的RNA是研究人员关注的问题.1987年Chomczynski等[1]建立了酸-异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法(acid-guanidine-phenol-chloroform, AGPC).该方法较以往的传统方法操作简单,无需特殊的设备,抽提时间缩短至4 h,因而得到广泛的应用.数家公司据此开发出RNA提取试剂盒[2,3].使用试剂盒简单方便,但价格相对昂贵.为探索操作简便、经济实用、快速有效的RNA提取方法,我们分析了大量相关文献资料,进行了多次实验,成功地研制出一种新型的RNA提取试剂,建立了其操作程序,我们称之为RNA快速提取一步法.其性能达到进口试剂盒的水平,但造价低廉、操作简便,特别适用于国内实验室.
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几种基因差异表达分析方法的比较
高等生物大约含有100 000个不同的基因,其中仅有约15%得到表达,基因表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制[1],因此,分析基因表达的差异不仅在发育、分化和突变等研究领域有着极大的应用价值,而且已成为基因克隆的有效手段之一,其技术发展也非常迅速.目前主要有差减杂交(subtractive hybridization,SH)、mRNA差异显示逆转录PCR(mRNA differential display reverse transcription PCR,DDRT-PCR)、cDNA代表性差异分析(cDNA representational difference analysis,cDNARDA)和抑制消减杂交(suppression sbtractive hybridization,SSH)等.尽管这些具有代表性的方法均不完善,不能通过它们得到所有的差异表达基因,但已经有大量的重要基因通过这些方法得到了分离和鉴定.本文就这些技术的主要原理、基本过程、优越性和主要缺陷做一比较分析.
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分子生物学技术在肝癌研究中应用
肝癌的发生是有其分子生物学基础的.自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子生物学研究,并取得了显著的成效.一类主要用于基因组DNA的检测,如肝癌基因和抑癌基因的定位克隆,比较基因组杂交,代表性差异分析;用于cD-NA或mRNA或mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、DNA芯片及探针微列阵等.这些技术的应用为肝癌的分子生物学研究开拓了一个崭新的领域.
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白细胞介素6诱导相关新基因的克隆与鉴定
白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)是一种多功能的细胞因子[1]。其作用于敏感细胞时,必将在胞内产生一系列新的信号分子。克隆这些受IL-6调控的新基因,必将有助于进一步阐明IL-6的信号转导机制及IL-6与某些疾病的相关性。我们用cDNA代表性差异分析(representational difference analysis of cDNA, cDNA-RDA)法在U937细胞中分离了与IL-6相关的基因。
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cDNA RDA及其在内分泌代谢疾病领域中的应用
不同种类细胞基因表达的差异决定其各种生命活动.正常生长发育及各种疾病病理过程的本质都与基因表达的改变有关.从基因表达水平即mRNA水平研究疾病的发病机理是非常重要的.下面介绍一种以聚合酶链反应(PCR)为基础的消减杂交技术--cDNA代表性差异分析(cDNA RDA).该技术是将PCR与消减杂交结合起来,用于不同细胞、组织之间基因表达差异的筛查,尤其是筛查那些特异、低丰度表达的基因效果更好.这种技术假阳性率极低,不需要特殊仪器,相对经济,有利于普通实验室开展基因筛查工作.
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甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析方法在筛查人非小细胞肺癌组织中高甲基化修饰序列的应用
目的 探讨甲基化CpG岛扩增联合代表性差异分析(MCA/RDA)方法在筛查人非小细胞肺癌(NSCLC)组织中高甲基化修饰序列的应用.方法 以92对NSCLC和癌旁对照组织DNA为研究对象,应用MCA/RDA方法筛查肺癌组织DNA中高甲基化修饰的CpG岛序列.应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和甲基化特异性PCR(methylation-sensitive PCR,MSP)技术,分析胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP-4)基因启动子区CpG岛的甲基化修饰与基因表达的相关性.结果获得5个经Slot Blot验证在肺癌组织中高甲基化修饰的CpG岛序列(IGFBP-4、KLK10、ADAM23、GADD45G和DUOX1).甲基化抑制剂5-aza-2′-deoxycytidine处理NSCLC细胞可明显上调IGFBP-4基因的表达.在41例(44.6%)癌组织中检测到IGFBP-4表达水平显著低于癌旁对照组织.47例(51.1%)癌组织检测到IGFBP-4高甲基化显著高于癌旁组织的检出率(16.3%,15/92;P<0.001).IGFBP-4高甲基化与基因表达呈负相关(r=-0.396,P<0.001).IGFBP-4高甲基化与TNM分期(P=0.013)和淋巴结转移(P=0.022)相关.结论 应用MCA/RDA方法筛查到5个在NSCLC组织中高甲基化修饰的CpG岛序列,并证实IGFBP-4启动子区CpG岛的高甲基化可能通过抑制基因的表达参与了NSCLC的发生.
关键词: 癌 非小细胞肺 甲基化CpG岛扩增 代表性差异分析 胰岛素样生长因子结合蛋白质4 -
卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染与肿瘤的发生
一、卡波济肉瘤相关疱疹病毒卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)系于1994年由卡波济肉瘤(KS)以PCR为基础的差别克隆技术(代表性差异分析,RDA)分离出的部分基因组.因该片段与EBV衣壳基因具有一些同源性,考虑其相关病毒为一种γ疱疹病毒,后经成功克隆其全长基因组而获确认.实际上,该病毒属与EBV所属γ1疱疹病毒(lymphocrytovirus)仅有一线之隔的γ2疱疹病毒(Rhadinovirus)亚科.γ疱疹病毒与α疱疹病毒一样,也广泛分布于哺乳类,现已分离出多种,EBV即为其一.这些病毒与B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或纤维肉瘤等肿瘤密切相关,其主要者列于表1.此一事实即为γ疱疹病毒可列举为DNA肿瘤病毒之一的1个理由.可以说KSHV同KS和原发性渗出性淋巴瘤(primary effusim lymphoma,PEL)的相关性几乎达100%,其与肿瘤发病如此密切相关者尚且无二.
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寒冷适应差异表达基因的研究
为寻找寒冷适应机体表达上调的相关基因, 以Balb/C小鼠建立寒冷适应模型, 分别提取肌肉和肝脏RNA, 运用代表性差异分析(RDA)方法, 寻找寒冷适应表达上调的相关基因片段, 进行序列分析和同源性比较.结果显示, 在肌肉和肝脏中有部分表达上调的基因片段, 经狭线杂交验证, 其中3条基因表达存在显著差异.这些新发现的机体寒冷适应相关基因为进一步理解寒冷适应的分子机制提供了帮助.
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日本血吸虫中国大陆株雌性特异性DNA片段及重复序列的分离与鉴定
目的分离鉴定日本血吸虫基因组DNA的雌性特异性片段及DNA重复序列.方法分别提取雌、雄日本血吸虫基因组DNA,制备检测子和驱动子;利用代表性差异分析(RDA)及PCR进行扣除杂交,获得目的DNA片段;对所获目的DNA片段用低熔点凝胶回收;转质粒载体、重组质粒载体的阳性克隆筛选、测序;用Southern blottmg对目的DNA片段进行鉴定.结果RDA及PCR获得5个目的DNA片段;并转质粒载体测定了5个目的DNA片段(P1~P5)的序列.Southernblottmg显示DNA片段P1和P2均与雌、雄基因组DNA强烈杂交;DNA片段P3与雌性基因组DNA的杂交强度明显高于与雄性基因组DNA的杂交强度;DNA片段P4和P5仅与雌性基因组DNA杂交,但不与雄性基因组DNA杂交.结论DNA片段P1和P2为日本血吸虫DNA重复序列,并以多拷贝存在于日本血吸虫基因组DNA中;DNA片段P3存在于日本血吸虫性染色体W和Z上,在性染色体W的拷贝数多于在性染色体Z上的拷贝数;DNA片段P4和P5仅存在于日本血吸虫性染色体W上,为日本血吸虫雌性特异性片段.
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基因差异表达研究方法的进展及其在肾脏科学研究中的应用
代表性差异分析、抑制性削减杂交、DAN芯片技术等研究基因表达改变的新方法较传统的类似方法有诸多的优越性,但也存在着一些缺点.本文就这些方法的原理、技术要点、优缺点和在肾脏发育、肾脏疾病发病机理和肾脏疾病相关基因克隆与鉴定等方面的应用进行了综述.
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TTV的病原学研究进展
1997年底,Nishzawa等[1]利用代表性差异分析(representational difference analysis)法,分离到一种新的DNA病毒,并认它可能与非甲非庚型肝炎有关.由于该病毒来自一份名为TT的输血后肝炎患者的血清,因此被命名为TT病毒,恰与经输血传播病毒(transfusion transmitted virusTTV)巧合.随后许多学者对TTV进行了广泛的研究,内容包括流行病学、病原学、临床表现等[2-6],其中TTV的病原学是研究得较深入的一个领域.本文就TTV的病原学研究新进展做一综述.
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聚合酶链反应为基础的差异表达基因分析技术及其在肾脏疾病研究中的应用
随着人类基因组计划的完成,探讨基因的功能及其在人类疾病中的作用是未来基因研究工作的重点.其中,基因表达的差异分析对阐明各种疾病的分子基础具有重要意义.自90年代以来,以聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为基础的差异表达基因分析技术,即:差异显示逆转录PCR(differential display reverse transcription-PCR,DDRT-PCR)、cDNA代表性差异分析(representational diffcrence analysis of cDNA,cDNA-RDA)和抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)等在肾脏疾病研究领域中被广泛应用并已经成功地分离和克隆了一些与肾脏疾病相关的基因.结合自己的研究工作,我们主要介绍这3种技术的基本原理、主要操作方法、各自的优、缺点以及它们在肾脏疾病研究中的应用.
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TTV的研究近况
1999年10月日本学者Nishizawa等[1]应用代表性差异分析(representational difference analysis)技术,从1例输血后肝炎患者的血清中克隆出一个500 bp片段(N22) ,并证实了N22与输血后肝炎有高度特异性,于是把该基因片段可能代表的病毒以患者的名字(TT)命名为TTV,同时也具经输血传播的病毒(transfusion transmitted virus)的含义. 1997年底,Okamoto等测定了TTV全基因序列.TTV是一个3.7 kb无包膜的单股DNA病毒,含有ORF1与ORF2两个开放读码框,分别编码770与202个氨基酸.蔗糖浮力密度为1. 26 g/cm3,氯化铯浮力密度为1.31~1.32 g/cm3,TTV全基因为3 739个核苷酸,其中A占31%(1 163),C占26%(954),G占23%(842),T占20%(780),有12个TATA序列,两个多腺苷酸化信号(AATAA),这些均属微小病毒科的病毒学特征.
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慢性肝病患者血清中抗-TTV的检测及其临床意义
目前,已发现与肝炎有关的病毒已有甲、乙、丙、丁、戊、庚6种,这些病毒均可经血清学和分子生物学诊断方法检测.但仍有5%~10%的肝炎病人病因不明.1997年底日本学者Nishizawa运用新的代表性差异分析技术(Represen-tational difference analysis)在输血后不明原因肝炎病人血清中发现了一种新的肝炎相关病毒,即输血传播病毒(TTV)[1].为了了解肝病患者TTV感染情况,我们对304例肝病患者及65例正常人进行了血清抗-TTV的检测,现将结果报告如下.
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新型嗜肝输血传播病毒(TTV)感染途径的研究现况
随着基因分子生物学技术的发展,甲~庚型肝炎病毒相继被发现,但在临床中仍有10%~20%的病毒性肝炎患者依然病因不明,无法用已建立的甲~庚型肝炎的实验室方法进行病原学分型,所以称为非甲~庚型肝炎.1997年12月日本学者Nishizawa等(1)应用代表性差异分析技术,从输血后肝炎患者的血清中克隆出新的肝炎病毒,并以该患者姓名的大写字母名为TTV,该命名恰巧与输血传播病毒(transfusion transmitted virus)三个英文名字的字头一致.随后的流行病学调查表明,人群中普遍存在TTV感染,且呈全球分布,感染率高,TTV除可经血传播以外,还存在其他的感染途径.现就TTV感染的传播途径研究现况综述如下.
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基因表达差异显示方法研究进展
分离差异表达基因,对于研究细胞生命过程的调节机制及研究致病机理具有重要意义.90年以来,先后出现了mRNADD、RDA、SSH、SAGE、DNA microarray等多种分离差别表达基因的手段,本文对以上方法的原理、基本步骤及其应用作了简要综述.
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分子生物学技术在肝癌研究中的应用
肝癌的发生是有其分子生物学基础的.自80年代以来许多技术相继开发应用到肿瘤的分子生物学研究,并取得了显著的成效.一类主要用于基因组DNA的检测,如肝癌基因和抑癌基因的定位克隆,比较基因组杂交,代表性差异分析;用于cDNA或mRNA或mRNA水平的技术包括消减杂交、差异显示PCR、cDNA代表性差异分析、DNA芯片及探微列陈等.这些技术的应用为肝癌的分子生物学研究开拓了一个崭新的领域.
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应用甲基化CpG岛扩增法结合代表性差异分析筛选结肠癌相关的甲基化DNA片段
目的研究结肠癌癌旁粘膜和正常结肠组织间DNA甲基化分布的差异以及甲基化在结肠癌发生中的作用.方法用甲基化CpG岛扩增(methylated CpG islands amplification, MCA)法富集基因组DNA甲基化序列,以癌旁粘膜DNA甲基化富集产物为检测子,正常结肠组织的甲基化富集产物为驱赶子进行代表性差异分析(representational difference analysis, RDA)获得DNA甲基化差异片段,经克隆、测序获得碱基序列.用生物信息学分析这些序列与相关基因结构的关系.结果获得25个不同的差异甲基化序列,位于相关基因的5′端、外显子、内含子和3′端.其中1A01片段位于CECR7基因的第1外显子和LOC256866基因的5′端及第1外显子;1A12片段位于GR6基因的第1外显子前204 bp处.符合DNA甲基化对基因转录的调控规律.以1A12片段为探针,点杂交分析表明,该探针与4轮RDA和检测子均有杂交信号,而与驱赶子无杂交信号.结论结肠癌癌旁组织和正常结肠组织的DNA甲基化存在差别,用MCA结合RDA方法可以有效分析这两种不同组织的甲基化分布差异.
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子宫肌瘤中差异表达基因的研究
子宫肌瘤是妇女常见的盆腔肿瘤之一,但其发病机制以及发生发展的分子生物学基础迄今未明.差异表达基因分析技术mRNA差异显示、代表性差异分析、抑制性消减杂交、DNA微阵列等可确定并克隆子宫肌瘤与正常肌层差异表达的基因,不仅有助于揭示子宫肌瘤的发病机制,而且为临床诊断和治疗提供新的思路.该文就差异表达基因分析技术在子宫肌瘤的应用进行综述.