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1株柯萨奇病毒A6型河南分离株全基因序列特征分析
柯萨奇病毒A6(CVA6)属于肠道病毒A组成员,主要引起疱疹性咽峡炎,也可引起手足口病.2011年河南地区从手足口病患者粪便标本中分离到1株CVA6,为了解其基因特征,本研究对分离的CVA6毒株进行全基因序列测定.1.材料与方法:待测毒株为2011年河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所实验室分离并鉴定的毒株,命名HN421.引物设计:根据原型株Gdula(AY421764)和日本毒株Shizuoka 18 (AB678778)序列,设计10对首尾相互重叠、覆盖全基因的引物(表1).RNA提取及反转录:将毒株接种于RD细胞,待病变达到75％时收获毒株,用美国Qiagen公司的Rneasy mini试剂盒提取RNA,用大连宝生物公司的PrimeScript 1-Strand cDNA Synthesis试剂盒反转录cDNA,所有操作均按说明书进行.
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2009年云南省柯萨奇病毒B3型分离株A103/KM/09全基因序列分析
目的 分析2009年云南省脑炎患儿粪便标本分离的柯萨奇病毒B3型分离株A103/KM/09全基因序列,了解其遗传特性.方法 设计针对柯萨奇病毒B3型引物,提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列,利用Geneious和Mega 5.05软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析,应用RDP 3和SimPlot 3.5.1重组软件对序列进行重组分析.结果 该分离株全基因组核苷酸序列长度为7389 bp.其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Nancy的同源性分别为81.0％和95.7％;与其他柯萨奇病毒B3型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81.0％～ 88.0％和95.7％～98.0％;进化分析发现CVB3可分为5个分支(Ⅰ～Ⅴ),核苷酸之间的差异为16.2％ ～ 24.3％;中国分离株属Ⅴ分支,又可分为A～D亚分支,核苷酸之间的差异为4.3％～11.4％.并发现A103/KM/09株基因序列在非结构区可能存在重组事件.结论 柯萨奇病毒B3型分为5个基因型,云南分离株A103/KM/09属于Ⅴ-D亚型,而中国分离株已经发生一定进化.
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狂犬病防制工作不容忽视
我国在公元前300多年就有狂犬病的记载，从发现狂犬病的那一天就开始了狂犬病的防治，并且随着医学生物学的发展和新技术的应用，有关狂犬病研究的各个领域也取得了可喜的成果。如狂犬病毒全基因序列的测定和分子结构的阐明，狂犬病毒致病的分子机理的日益明确和狂犬病毒基因工程口服疫苗的研究和应用。我国在狂犬病预防和研究领域也取得了可喜的成绩，如人狂犬病已从80年代的每年数千例降至目前的数百例；Vero细胞纯化狂犬病疫苗的研制成功；人腺病毒和禽痘病毒为载体表达狂犬病毒糖蛋白和/或核蛋白制备基因工程疫苗已在动物实验中证实有保护作用。与此同时我们也应看到仍有许多问题有待于继续努力和解决。 目前人狂犬病多见于亚洲的印度、泰国、斯里兰卡、柬埔寨、孟加拉国、越南和缅甸等国家,而北美和欧洲，狂犬病主要限于野生动物中。我国仍属于人狂犬病严重流行的国家之一,我国周边地区很多也是狂犬病高发病国家。从这种人、动物狂犬病的分布可以看出，人狂犬病流行的国家大都属于尚不够发达或比较落后的国家，这也揭示了一个社会整体治理的水平问题。因为狂犬病的流行很多是人为造成的，是与整个社会的文明程度和法规秩序有着直接的关系。目前在国际上，我国已逐步被列入发达国家行列，在许多领域，我们已经居世界领先地位。可是我们在狂犬病的防制方面与众多飞速发展的领域不相符合。因为一个国家的发展和先进要体现在方方面面，疾病预防与控制是其中非常重要的一个方面。狂犬病是我国《传染病防治法》中明确规定必须报告的乙类传染病之一。在过去，死亡数一直位居35种法定报告传染病之首，从80年代到90年代中期，由于国家和各级政府的重视，我国在狂犬病的控制方面卓有成效。但令人遗憾的是随着狂犬病疫情的下降，这种政府参与的多部门的联手协作没有能够继续下去，致使各部门各自为政，有些地区甚至处于无人管理状态，这种缺乏整体和全面有序的工作现状很难使狂犬病从根本上得到控制。
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西藏部分地区12株藏族人群C/D重组型乙型肝炎病毒全基因序列分析
为了解藏族人群中流行的乙型肝炎病毒(HBV)基因型及基因重组状况,收集藏族人群HBsAg阳性样本,提取HBV DNA并用巢氏PCR的方法扩增HBV全长序列,测序后用DNAstar软件拼接全基因序列,进一步利用MEGA6和Simplot软件进行序列同源性和系统进化分析.应用该方法获得12株藏族人群HBV全基因序列,分析结果显示12株样本为C/D重组型,其中9株样本的重组位点位于nt750,3株样本的重组位点位于nt 1526,以此可分为两种重组方式,分别命名为C/Da和C/Db;从总体序列同源性来分析12株样本均属于C基因型,且与现有的C1-C15亚型的核苷酸差异均大于4％,与C1亚型为接近.从地理分布来看,C/Da来自西藏中部和北部的拉萨市、阿里和林芝地区,C/Db均来自西藏南部的山南地区,提示两种重组型C/Da和C/Db在西藏地区的地理分布具有一定规律.研究结果可为西藏地区特殊HBV基因重组、基因特征分析、病毒进化研究以及当地乙肝防控提供参考.
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福建省甲型H1N1流感病毒基因特征研究
为了解福建省甲型H1N1流感病毒基因变异特征和规律,对2009～2012年福建省分离的14株甲型H1N1流感病毒进行了全基因序列分析.结果发现,所有的毒株均是典型的低致病性流感病毒,对金刚烷胺类药物耐药,对神经氨酸酶抑制剂敏感.所有毒株与A/California/07/2009(H1 N1)疫苗株保持高度同源,8个节段基因同源性均在98.2％以上.相比之下,福建省2012年的流感毒株抗原变异程度较大,其中A/Fujiangulou/SWL1155/2012毒株HA基因发生11个氨基酸位点改变,其中H138R、L161I、S185T和S203T位点的变异分别涉及Ca、Sa和Sb抗原决定簇.监测显示,疫苗对福建省人群保护效果较好,但福建省2012年毒株相对疫苗株已经出现抗原漂移,应进一步密切关注其变异情况.
关键词： 甲型H1N1流感病毒 全基因序列 变异 基因特征 -
我国首株猪盖他病毒的分离与鉴定
盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种广泛分布于欧亚大陆及澳大利亚北部太平洋沿岸的人兽共患虫媒病毒,我国目前各地仅从蚊子中分离到该病毒.本研究在对一猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)流产胎儿进行多重RT-PCR检测时,由检测猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的一对引物扩增出一非特异性条带,测序及在NCBI数据库中BLAST结果显示,该序列与GETV序列高度相似.经病毒分离、传代、蚀斑纯化,获得一株能够在Marc-145细胞上稳定生长的分离物.电镜观察显示,该病毒有囊膜及纤突,直径约70 nm,接近于球形,具有披膜病毒科甲病毒属成员的典型形态特征,将该分离物命名为HNJZ-S1株盖塔病毒(Getah virus).全基因序列分析结果显示,分离物HNJZ-S1基因组全长11 689 bp,与GenBank中现有14株GETV序列相似性为97.4％～99.3％,其与韩国猪源毒株AY702913(登录号AY702913)序列相似性高(99.3％).遗传进化分析显示,HNJZ-S1与日本蚊源毒株12IH26、马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2及中国蚊源毒株HB0234亲缘关系近,处于同一进化分支.其E2基因推导的氨基酸序列分析结果显示,HNJZ-S1与韩国猪源毒株AY702913和QIAG9302以及日本马源毒株14-I-605-C1、14-I-605-C2和中国蚊源毒株HB0234等处于同一进化分支.本研究首次从我国发病猪群中检测并分离到GETV,也是迄今为止中国唯一一株来自脊椎动物的盖他病毒,对猪源GETV的感染谱和致病性、感染和传播机制、环境微生物学及公共卫生等相关研究具有重要意义,并为之提供了宝贵的研究素材.
关键词： 猪 流产胎儿 病毒分离 盖他病毒(GETV) 全基因序列 -
一株神经外低毒力乙型脑炎病毒株的全基因序列分析
目的 探究1株新分离的基因Ⅰ型乙脑病毒株的分子生物学特征及其低毒力的分子基础. 方法 对病毒株扩增,提取其RNA,逆转录PCR后测序,序列与来自世界不同地区不同基因型的野毒株进行同源性比较,并与强毒P3株进行氨基酸位点比对. 结果 SC04-17在核苷酸和氨基酸序列上,存在与其他基因型毒株不同的特点,与世界各地毒株核苷酸差异率为1.8%～16.5%,氨基酸差异率为0.8%～5.0%;与减毒活疫苗株SA14-14-2的核苷酸、氨基酸同源性分别为88.5%和97.6%,与灭活疫苗株P3核苷酸、氨基酸同源性分别为88.8%和97.9%;与P3强毒株比对,发现72个氨基酸位点差异,分布在全基因的各个区域(E、NS5、NS1和NS3区).结论 SC04-17株的基因序列存在一些独特位点,这些位点的氨基酸变化可能与其低毒力特征有关.
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中国甲型肝炎病毒龙甲株全基因序列的cDNA克隆及序列分析
甲型肝炎是我国主要传染病之一,经粪-口途径传播.甲型肝炎病毒(HAV)在组织培养中生长缓慢,滴度低,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产.因此有必要克隆我国自己的HAV基因,为体外表达HAV抗原打下基础.HAV属小RNA病毒科肝病毒属,为无包膜的单链RNA病毒,含有长约7.5 kb的正链RNA,5′端有长的非编码区,3′端有polyA的尾巴.基因组含有一个长的开放读码框架,编码2 227个氨基酸的大蛋白.基因排列顺序为:5′-NCR-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′NCR,其中VP4至VP1为结构蛋白区又称P1区,2A至3D为非结构蛋白区,又称P2(2A-2C),P3(3A-3D)区.HAV只有一个血清型,结构蛋白抗原具有构型依赖性,抗原序列相对保守.其中5′NCR、2B、2C、3A及3′NCR区对细胞培养株的适应性有关,3C为蛋白酶区,几乎切割多蛋白的所有位点,3D为RNA聚合酶区[1].我们对我国HAV龙甲株全序列的cDNA克隆及序列进行了分析,并与HM175株[2]和MBB株[3]以及已发表的甲肝病毒龙甲株结构区基因[4]进行了比较.
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9株YONBAN相关TTV变异株全基因序列测定及其结构、分型的研究
目的对9个TTV新分离株全基因序列测定、基因结构及基因分型的研究.方法从9名TTV第4基因群感染阳性的婴儿血清中抽提其DNA,用longinverted PCR扩增出全基因组、克隆和测定全基因组序列,并对测序结果进行计算机分析.结果首次测定了TTV第4基因群共9个新分离株的全基因序列,其中8个分离株代表该基因群首次报道的8个新基因型.结论TTV基因组核酸序列具高度异质性及基因型的高度多样性,但是,其独特的转录特性和基因组的基本结构在各自的基因群及基因型中十分保守.
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浙江丽水市畲族人群乙型肝炎病毒基因型分布研究
根据乙型肝炎病毒(HBV)全基因序列的差异≥8%或S基因序列≥4%,可以将HBV分为A～H等8种基因型.不同基因型致病性及治疗效应不同.为了解丽水市畲族人群乙型肝炎病毒基因型的分布特点及其与混居汉族人群乙型肝炎病毒基因型分布是否存在差异,我们随机抽样检测了1744例畲族及混居的557例汉族人群血样,对其中的HBVDNA阳性者采用荧光定量PCR法(试剂由深圳匹基生物工程有限公司提供)进行病毒基因分型检测,现将结果报告如下.
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2009年云南省 Echo30分离株 KM／A363／09全基因组序列分析
目的：对2009年从中国云南省1名脑炎患儿粪便标本中分离到的Echo30云南分离株KM／A363／09进行全基因组测序和分析，了解该株病毒的遗传特性。方法设计针对Echo30引物，提取病毒RNA、RT-PCR扩增和产物直接测序获得全基因组序列，利用Geneious和Mega5．1软件进行核苷酸、氨基酸序列比对及其系统进化分析，应用RDP3和SimPlot3．5．1重组软件对序列进行重组分析。结果该分离株全基因组核苷酸序列长度为7425 bp，编码2194个氨基酸。其核苷酸和氨基酸序列与其原型株Bastianni的同源性分别为81．2％和95．8％；与其他Echo30型毒株的各区段核苷酸和氨基酸同源性分别为81．2％～88．6％和95．8％～97．8％；进化分析发现KM／A363／09毒株属于中国Echo30分支中的一支。而且发现KM／A363／09株基因序列在非结构区可能存在重组事件。结论云南分离株KM／A363／09属于中国Echo30分支中的一支，而中国分离株已经发生一定的进化。
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采用多对型特异性引物巢式PCR法研究江西省HBV基因型分布及其临床相关性
根据HBV全基因序列的差异≥8%或者S区基因序列差异≥4%可将其分为A、B、C、D、E、F等基因型.HBV基因型的分布具有地域性,东南亚地区慢性乙型肝炎病毒感染者中以B和C基因型为主.在我国,北方地区以C型为主,南方以B型为主[1].全国很多省份和城市都已有HBV基因型分布的相关报道.基因型检测方法较多,各有其优缺点,温志立等[2]在国内先应用的多对型特异性引物巢式PCR法较其他方法更为简便、经济,适用于大规模标本鉴定,本研究拟采用此法测定江西地区HBV基因型,并同时进一步观察基因型与临床的关系.
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乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2kb,结构基因与调节基因序列之间重叠,甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后,一直沿用至今.我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp,编码产物为56aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60肝,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
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乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的认识
全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者3.5亿人.对于HBV多年的研究已经积累了丰富的资料,但是,我们对于HBV基因组特性的认识远远没有穷尽,事实上还有许多方面需要进行探索.通过对特定慢性HBV感染者血清中不同的HBV病毒基因克隆序列的比较提出了HBV准种特点,使我们对于HBV基因组结构与功能的复杂性有了更为深入的了解.野生型病毒之间、野生型病毒与突变型病毒之间、突变型病毒之间的反式调节机制是各种类型的缺陷型HBV存在的重要条件和机制,也是HBV感染引起肝细胞癌(HCC)的重要的分子生物学机制.外周血中存在羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBst)的编码基因,使我们对于HBV基因编码的反式激活蛋白的类型有了新的认识.通过对克隆的HBVDNA全长基因序列的比较,以及与其他地域所流行的HBV DNA序列之间的比较,发现了新型的开放读码框架(ORF),如前-X(pre-X)蛋白的编码基因和前-前-S(per-pre-S)蛋白的编码基因.长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)技术克隆的HBV DNA全长序列,是我国流行的adr亚型的HBVDNA全基因序列,代表了真正存在的HBV的基因全长序列,在HBV基因结构与功能的研究中,以及在抗HBV治疗疗效应答的研究中具有重要的理论和实际应用价值.
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乙型肝炎病毒中国流行株全基因的克隆与序列分析
目的:从中国慢性乙型肝炎患者的血清中,应用长距离多聚酶链反应技术(L-PCR)技术扩增、克隆乙型肝炎病毒(HBV)的全基因组序列,建立中国HBV流行株的参考标准序列.方法:从2例慢性乙型病毒性肝炎患者血清提取DNA,以L-PCR技术对于3 200 bp的HBV DNA进行扩增,纯化后克隆到TA载体中进行序列分析.对于HBV DNA的各个编码基因区进行分析.结果:克隆获得的5个HBV DNA全基因序列分别为G376-A6、G376-A7、G683-A1、G683-A2和G683-A3,全基因序列长度分别为3 125、3 215、3 213、3 182和3 215碱基对(bp),在GenBank中的注册号分别为AF384372、AF384371、AF363963、AF363962和AF363961.其中G376-A6、G376-A7来源于同一个患者,G683-A1、G683-A2、G683-A3来源于另一个患者.G376-A6、G683-A2两株病毒在前-S1区存在缺失突变区.其中G683-A2的羧基末端区存在缺失突变.来源于不同患者的e/核心抗原蛋白质一级结构序列没有显著的差别,但来源于同一个患者的HBV基因序列有着明显的同源性.G376-A6、G683-A2两株病毒存在多聚酶蛋白区的缺失突变,但不在多聚酶蛋白的活性结构区,因此考虑这种形式的突变尚不会影响到多聚酶的活性.G683-A3株病毒的多聚酶在其羧基末端存在较长的缺失突变区,使其多聚酶区结构被破坏.5株病毒的X蛋白的一级结构序列比较的结果说明其高度保守.但是相对来讲,X蛋白的氨基末端更为保守,羧基末端序列有一定程度的变异.结论:克隆了HBV DNA中国株的全基因序列,可以作为研究中HBV流行株的参考序列.
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不同载体表达核酶对HBV mRNA细胞内表达的阻断作用
目的:探讨多位点自剪切核酶及突变核酶对细胞内HBVmuRNA的切割作用.方法:构建5个不同的多位点核酶及突变核酶的真核表达载体,将他们分别与乙型肝炎病毒全基因序列共转染HepG2细胞,用ELISA,共聚焦定量及图像分析的方法观察多位点核酶在细胞内对HBV mRNA切割作用.结果:构建的真核表达载体在细胞内确可表达出多位点核酶,核酶及突变核酶在细胞内对HBV基因的表达均有抑制作用,不同表达载体的抑制率不同,以tRNA启动子的表达载体抑制效率高,达81%,突变核酶亦有部分反义RNA的抑制效果.结论:抗乙型肝炎病毒核酶在细胞内可抑制HBV基因的表达,不同表达载体其核酶的表达效率不同.
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乙型肝炎病毒X蛋白与去唾液酸糖蛋白受体2突变体相互作用的研究
目的:筛选并克隆鉴定人肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,明确HBxAg在HBV感染及致癌过程中的具体作用.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出阳性目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录出去唾液酸蛋白受体2(ASGPR2)突变体的完整序列,克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,体外免疫共沉淀再次证明HBxAg与ASGPR2突变体的结合作用.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-His-Ade)培养基又能分解X-α-半乳糖(X-α-gal)变成蓝色的真阳性菌落41个,其中有一个是ASGPR2的新突变体.HepG2细胞的mRNA中能逆转录出ASGPR2的全基因序列,体外免疫共沉淀结果证实该突变体与HBxAg在体外也有结合作用.结论:成功克隆出HBxAg的肝细胞结合蛋白,发现一新的ASGPR2突变体,并证实HBxAg与ASGPR2突变体在体外及酵母细胞内均有结合作用.
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乙型肝炎病毒基因型流行病学与临床
HBV是小的人类DNA病毒,其基因组全长仅为3200个碱基,以部分环状双链存在.其中负链为完整的环链,包括4个相互重叠的读框:前C/C基因、P基因、S基因和X基因.1988年,Okamaoto等比较了18株HBV全基因序列,将它们分为4组,并命名为A～D,并指出,依据核苷酸序列异质性≥8%可将HBV毒株分成不同的基因型,这个分型标准延用至今.进一步研究HBV全基因序列以及它们之间的进化关系,发现了另外4个基因型:E、F、G和H.以下结合我们在HBV基因型研究方面的工作,介绍有关研究进展和初步共识.
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干扰素治疗慢性乙型肝炎疗效影响因素的研究进展
我国是病毒型肝炎的高发区.据统计,全世界HbsAg携带者约3.5亿,其中我国约1.2亿,慢性乙型肝炎病人约3000万.作为一种传染病,乙型肝炎病毒(HBV)感染者中,约25%终将死于重症慢性肝病、肝硬化及肝癌.因此,学者们对乙型肝炎的治疗尤为关注.自1979年测定了HBV全基因序列以来,很多学者在研究乙型肝炎的抗病毒治疗.
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宁波市肠道病毒71型分离株全基因序列对比分析
目的 探讨浙江宁波地区2010年分离的肠道病毒71型( EV71)中神经毒性相关位点.方法 采集宁波地区2010年手足口病不同症状患者粪便标本,进行荧光聚合酶链反应检测,阳性标本病毒分离；分8个片段对EV71全基因序列和VP1区进行逆转录聚合酶链反应(RT - PCR)、克隆、测序、拼接、同源性比较,用DNAstar推导其内含子编码的氨基酸序列并比对分析.结果 6株分离株基因全长均为7 406 bp,核苷酸同源性为97.9％～99.4％,其中3株死亡病例标本内部核糖体进入位点(IRES)中的124、272及408位,碱基分别为T、G、A,区别于其他3株手足口轻症患者分离株的A、A和G；3株死亡病例标本位于主要衣壳蛋白VP1区的第715位氨基酸和3C蛋白酶的第1704位及1706位的氨基酸分别为甲硫氨酸(met)、精氨酸(arg)及异亮氨酸(ile),区别于3株轻症病例的亮氨酸(leu)、赖氨酸(lys)及缬氨酸(val).结论 宁波地区2010年分离的EV71 IRES、VP1与3C位点变异与EV71神经毒性相关.
关键词： 肠道病毒71(EV71)型 全基因序列 同源性
