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冠心病血瘀证相关基因研究
目的:筛查冠心病血瘀证病证结合相关基因.方法:区组选择符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40例,运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序,并进行生物信息学分析.结果:得到了28条真实差异基因片段序列,于NCBI human genomic数据库中比对分析,获得了与人类基因100%同源的3条(b13、49b、23b),99%同源的2条(b12、36a),98%同源(25b、57d)2条.其中的b13为淋巴细胞活化信号分子家族成员1,表达于T、B细胞表面,参与多系统的炎症反应,促进Th2类细胞因子的分泌,在冠心病血瘀证组呈高表达.23b系BCL2相关转录因子1,参与凋亡调控基因BCL2的转录过程,明显表达于冠心病血瘀证组.结论:差异基因中b13、23b从不同途径,导致或参与了脂代谢、血液高粘高聚高凝状态的形成,并通过分泌炎性细胞因子,调控细胞凋亡,参与了内皮损伤和动脉硬化的形成.与冠心病血瘀证的病理改变密切相关.
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冠心病血瘀证相关基因b13的筛查和临床验证
目的:筛查冠心病血瘀证病证结合证候相关基因.方法:临床区组选择符合诊断标准的冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证、非冠心病血瘀证患者和正常健康者共40人,运用外周血mRNA差异显示获得差异条带、反向Northern法阳性验证、克隆测序,并进行生物信息学分析和临床验证.结果:得到的28条真实差异基因片段序列,与人类基因数据库中比对分析,获得的b13与人类基因淋巴细胞活化因子1有100%的同源性,在冠心病血瘀证组显著表达.结论:差异基因b13通过T淋巴细胞的活化,引起免疫反应,导致进一步内皮损伤,刺激内皮细胞表达细胞因子、趋化因子及细胞黏附分子,促进炎性细胞黏附及脂质沉积,参与了内皮损伤和动脉硬化的形成.与冠心病血瘀证的病理改变密切相关.
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3种藏药基原植物遗传多样性研究
通过野外采集、分类学鉴定及多基因组多片段相结合,对2012年版《西藏自治区藏药材标准》中"桑蒂"、"莪德哇"和"叶兴巴"3种藏药基原植物的遗传多样性进行分析研究.经鉴定它们的基原植物分别为毛萼獐牙菜Swenia hispidicalyx、全萼秦艽Gentiana lhassica和齿叶玄参Scrophularia dentata;直接测定各样品的核糖体DNAITS区、叶绿体matK,rbcL,rpoC1,trnL(UAA),sbA-trnH,atpB-rbcL,trnS(GCU)-trnG(UCC),rpl20-rps 12,trnL(UAA)-trnF(GAA)及线粒体nad1第2内含子序列共93条;毛萼獐牙菜、齿叶玄参的ITS区存在杂合,通过TA克隆法获得60条克隆序列.将克隆序列分为不同的基因型;基于所获全部序列及近缘物种相关序列,探讨3种藏药基原植物的遗传多样性,构建了全萼秦艽的DNA条形码.该工作可为不同遗传背景的藏药基原植物物种鉴定DNA条形码的建立提供新思路及基础资料.
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基于全基因组和准种序列分析3株HAV流行株基因特征
目的 分析3株甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)流行株全基因组和准种序列特征.方法 收集某地3例急性期甲肝患者血清标本,经病毒核酸提取、逆转录、分段巢式PCR,获得HAV近全长序列,并对全长VP1-2 A区进行克隆测序.结果 VP1-2 A连接区分型结果表明3株HAV均属于IA亚型,3株序列在此区核苷酸和氨基酸同源性为100％;全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9％ ～ 100％和100％,与GenBank中日本AH2株同源性高(核苷酸、氨基酸同源性为98.5％和99.7％);在已发表的抗原中和位点处未出现氨基酸变异.每株流行株全长VP1-2 A区克隆序列内、以及所有克隆序列间,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0％ ～ 100％、98.1％～100％和99.0％～100％、97.2％ ～ 100％,VP1-2 A连接区的核苷酸和氨基酸变异率高于部分VP1区.结论 3株流行株VP1-2 A连接区分型序列一致,全长基因组及准种序列间核苷酸、氨基酸序列同源性较高,推测可能为同源感染.本研究为甲肝病毒在传播过程中的遗传变异特点及溯源调查提供参考依据.
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乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究
近年来的研究提出HBV感染者体内存在有准种的假说,我们以前C/C基因为研究靶区域,应用多聚酶链反应(PCR)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶序列,随机选择克隆测序,比较其结果,证明了HBV准种的存在,并发现多种基因突变形式.
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解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测序及其在大肠埃希菌中的表达
我们采用基因工程方法对解脲脲原体(Uu)标准株4型MB抗原基因进行体外扩增、测序及表达,为Uu疫苗和快速诊断试剂盒的研制奠定了基础.
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乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义
乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2kb,结构基因与调节基因序列之间重叠,甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架(ORF)之后,一直沿用至今.我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp,编码产物为56aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎(CHB)患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60肝,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
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乙型肝炎病毒基因组前-前-S基因区的分子流行病学研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在前-前-S编码基因,并探讨前-前-S基因与HBV基因型分布之间的关系.方法:自慢性乙型肝炎患者血清中提取病毒基因组DNA,首先应用多引物-多聚酶链反应(PCR)进行HBV基因型分型,之后将前-前-S区扩增,TA克隆到pGEM Teasy载体后进行单克隆测序,利用Vector 8.0软件进行序列分析.结果:选择15例患者,经过HBV基因型分型实验确定基因型为B型者1例,B/C混合型者5例,C型9例.自15例患者血清中提取的HBV基因组中扩增出前-前-S基因片段,TA克隆后选择31个克隆进行测序,测序结果证明这31个克隆均编码前-前-S基因.结论:前-前-S区编码在B、C基因型中均为普遍存在的现象.
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乙型肝炎病毒基因组前-X区的分子流行病学研究
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组是否存在前-X编码基因,并探讨前-X基因与HBV基因型之间的关系.方法:自慢性乙型肝炎患者血清中提取乙型肝炎病毒基因组,首先应用多引物-多聚酶链反应(PCR)进行HBV基因型分型.之后将前-X区扩增,TA克隆到pGEM Teasy载体后进行单克隆测序,利用Vector 8.0软件进行序列分析.结果:17例患者中,A型者1例,B型3例,B/C混合型者3例,C型10例.克隆测序的45个克隆中,27个(60%)克隆编码前-X多肽,其中18个(66.7%)克隆来自C基因型.有3种形式突变导致前-X区编码不能.前-X区多肽具有个体化突变现象.结论:前-X区编码在B、C基因型中均为普遍存在的现象,其编码具有C型倾向性.
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智能扩增检测法检测非小细胞肺癌患者血浆及肿瘤组织中表皮生长因子受体突变的研究
近年来,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的发病率逐年增高,严重威胁着人类的健康.表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)改变了NSCLC患者的治疗策略.EGFR突变是该类药物的预测因子,在NSCLC的治疗决策中起重要作用[1].对晚期患者而言,获取肿瘤组织检测EGFR突变存在困难,有学者曾尝试在NSCLC患者体液中检测EGFR突变,但标本中肿瘤细胞DNA含量少且不稳定,对检测技术要求高.因此,本研究设计了相应的智能扩增检测(smart amplification process,SMAP)体系,检测晚期NSCLC患者肿瘤组织及外周血浆中EGFR突变,以传统测序及扩增阻滞突变富集技术(amplification refractory mutation system,ARMS)作为对照,并用克隆测序进一步验证结果,探讨SMAP法检测EGFR突变的稳定性和可靠性.
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龋病患者龈上菌斑微生物多样性的研究
目的 探讨有龋和无龋成年人龈上菌斑中微生物的组成特点及多样性差异,以期为龋病的病因学研究提供依据.方法 有龋组选择2013年7月至9月于首都医科大学口腔医学院牙体牙髓科就诊的患者,男女各8例,年龄18～ 35岁,龋失补牙数(decayed tooth and decayedmissing-filled-tooth,DMFT) ≥6且龋齿数≥3;无龋组选择同年龄段DMFT=0的知情同意者,男女各8名.每组16例.分别采集两组受试者龈上菌斑样本,应用PCR-变性梯度凝胶电泳(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)联合克隆测序法对细菌组成进行研究.结果 两组共检测到6个菌门、28个菌属、88个菌种.有龋组中普氏菌属、二氧化碳噬纤维菌属、放线菌属、韦荣菌属及棒状杆菌属的检出率较高,这5个菌属克隆数的总和占有龋组总克隆数的56.2％(334/594).与有龋组相比,无龋组拥有更丰富的优势菌属组合,普氏菌属、韦荣菌属、二氧化碳噬纤维菌属、棒状杆菌属、链球菌属、放线菌属、Aggregatibacter菌属和奈瑟菌属的检出率较高,8个菌属的克隆总数占无龋组总克隆数的65.2％(354/543).有龋组微生物在菌种分类水平上的各个多样性指数均显著低于无龋组,差异有统计学意义 (P＜0.05).结论 龋病的发生并非由单一菌种所致,可能为多种细菌共同作用的结果;随着龋病的发展,龈上菌斑中的微生物多样性下降.
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西藏小型猪MSTN基因分子克隆及序列分析
目的：扩增西藏小型猪的肌肉生长抑制素（ MSTN）基因编码区全长序列，并对序列进行生物信息学分析。方法提取西藏小型猪肝脏组织的RNA，反转录成为cDNA，利用RT-PCR方法扩增MSTN基因编码区全长序列，将纯化的片段与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆并测定其序列，利用生物信息学方法分析其序列特征，并与其他12种物种构建系统进化树。结果西藏小型猪MSTN基因编码区全长1128 bp，编码375个氨基酸，氨基酸序列同源性分析表明，与版纳微型猪MSTN氨基酸序列相似性高，为99％。结论 MSTN基因西藏小型猪除了与鸡和斑马鱼亲缘关系较远外，与人、犬、版纳微型猪、绵羊、山羊、牛、马、黑猩猩、大鼠、小鼠的关系都较为接近，其中与版纳微型猪的亲缘关系为接近。
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16S rDNA克隆文库法与PCR-DGGE法在口腔菌群分析中的对比研究
目的 比较16S rDNA克隆文库法与变性梯度凝胶电泳联合PCR法(PCR-DGGE)在口腔微生物多样性研究中的检测效率. 方法 采集6例逆行性牙髓炎患者根管细菌样本,提取细菌总DNA,采用细菌通用引物27F/1492R、HAD-1/2分别扩增16S rDNA的全长或V2-V3区域,PCR产物分别经琼脂糖凝胶电泳和DGGE分离,纯化目的条带后克隆测序.测序结果与数据库序列比对,鉴定细菌组成. 结果 琼脂糖电泳分离到16S rDNA约1.5 kb条带,每个样本检测到8-15种细菌;DGGE分离到V2-V3区约含6-12条位置不同的239 bp谱带,每个样本检测到6-12种细菌. 结论 与DGGE法相比,16S rDNA克隆文库法测得的菌群更全面,敏感性和特异性更高.
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克隆测序技术在小鼠心肌炎实验中的应用
目的:应用克隆测序技术结合观察急性病毒性心肌炎模型的发病过程及病理改变,从病原学及病理学角度鉴定柯萨奇病毒B3亲心肌株(CVB3m)诱导BALB/c小鼠急性病毒性心肌炎(VMC)模型,为VMC模型提供科学的鉴定方法.方法:以CVB3m腹腔注射诱导BALB/c小鼠心肌炎,分别于3、5、7、10、14天取心肌,以RT-PCR法检测CVB3m,并通过质粒克隆测定cDNA序列;同时观察小鼠心肌病理组织学变化.结果:感染小鼠心肌组织中RT-PCR扩增产物与已知CVB3mcDNA序列相应片段吻合度＞99.3%;小鼠心肌病变从心肌细胞肿胀、少数淋巴细胞浸润到坏死和炎性病变随病程发展逐渐增多,第10天达高峰,至第14天炎症逐渐恢复,出现不同程度的纤维化.结论:提示用克隆测序法鉴定为VMC发病机理及药物防治研究提供了稳定可靠的动物模型,并为研究CVB3m病毒感染小鼠后基因变异提供了参考依据.
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二代测序应用于检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH启动子的DNA甲基化状态的研究
目的:利用二代测序技术检测GT1-7细胞中KISS1和GnRH基因启动子范围内的甲基化状态,并用金标准的亚硫酸氢盐修饰后的克隆测序作为对照,比较二代测序与金标准克隆测序在研究DNA甲基化检测中的差别.方法:提取GT1-7细胞基因组DNA并进行亚硫酸氢盐处理.进行巢式PCR,将PCR产物进行二代测序.同时采用金标准的亚硫酸氢盐修饰后克隆测序的方法作为对照,对相同批次的PCR产物进行克隆测序.结果:PCR产物二代测序结果表明KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整,结果准确.挑取10个克隆进行一代测序结果表明序列无丢失,KISS1和GnRH两个基因的27个CpG甲基化位点信息完整.结论:利用高通量的二代测序技术能够有效的对DNA甲基化的PCR产物进行检测,二代测序和克隆测序都是研究DNA甲基化的有效方法,但前者与克隆测序相比每一个读取序列(reads)都相当于一个单克隆,且二代测序每个区段得到成百上千个reads,因此二代测序结果更加精确.
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1例HCV不同基因型/亚型混合感染的确认
目的:鉴定1例NS5B区和E1区PCR产物测序结果分型不一致的HCV病毒株为基因重组还是混合感染.方法:提取血浆的病毒总RNA,逆转录后进行巢式PCR扩增,以NS5B和E1编码区为目的基因进行PCR扩增并测序,通过构建进化树进行基因分型,发现两个编码区基因分型的结果不同,对NS5B和E1区进行克隆测序,每个编码区分别挑取50个克隆进行测序和基因分型;针对HCV全长序列分别设计7对型特异性引物并进行PCR扩增.结果:NS5B(8 256 ～8 641 bp)区PCR产物测序后的分型结果为1b,E1 (697 ～1 322 bp)区为2a;NS5B(8 266 ～9 274 bp)基因的50个克隆测序结果均为1b,C/E1 (849 ～2 152 bp)基因的50个克隆测序结果均为2a;7个片段的PCR型特异性扩增以及进化分析发现,在同一区域既存在1b亚型,也存在2a亚型.结论:该病例为1b和2a的混合感染.
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新疆出血热病毒S基因片段的测序和分析
新疆出血热(Xinjiang Hemorrhagic Fever,XHF)既克里米亚--刚果出血热(Crimean Congo Hemorrhagic Fever,CCHF)在我国新疆地区严重流行,病死率较高;近几年XHF的抗体也在许多省区的家畜或人血清中发现,是又一个不容忽视的公共卫生问题.为认识XHF病毒的本质,从分子水平揭示其基因结构与功能的关系,寻找传播及流行的原因,对1965年分离自我国首例病人及1984年分离自蜱的两株XHF病毒进行了S基因片段的克隆测序和分析.结果两株病毒核苷酸序列同源性为96.7%,与已经发表的1968年分离自我国蜱(HY13)和羊(C68031)的两株病毒核苷酸序列同源性均较高(96.7%～99%);与其它CCHF病毒相比S基因同源性为77.4%～92.7%.计算机绘出的系统发生树状图显示我国分离的四株病毒形成一单个群体并进一步分为三组,提示流行源自我国.
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非培养法检测肝硬化患者腹水真菌的实验研究
目的 探讨PCR克隆测序法检测肝硬化患者腹水中真菌的可行性.方法 运用真菌通用引物对7种对照真菌菌株、3种细菌菌株进行PCR扩增,验证引物可行性.收集158例肝硬化患者的腹水标本,提取DNA后进行PCR扩增,克隆测序鉴定真菌种类.同时用培养法对腹水标本进行真菌培养,比较两种方法的差异.结果 7种真菌菌株均可得到1000bp左右的片段,而3种细菌菌株未检出相应片段.158例肝硬化患者腹水中真菌DNA检出率为7.0％,而腹水培养真菌阳性率只有1.3％,二者比较有统计学意义(P＜0.05).2例真菌培养阳性结果与PCR法鉴定菌株完全一致.结论 真菌通用引物扩增真菌DNA具有高度特异性、敏感性.PCR能用于检测腹水中真菌DNA,且PCR法可检出一些培养无法检测到的真菌.
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MICA新等位基因MICA?008：05的DNA序列鉴定及分析
目的：采用直接测序法及克隆测序法确认新等位基因 MICA?008：05。方法采用 Sequence Base Typing （ SBT）法分型技术对MICA的多态性进行常规基因分型，采用克隆测序法进行确认并与已知的等位基因序列进行比对。结果发现1个样本在外显子3上有1个碱基位置与国际通用MICA数据库不相符。该基因与MICA?008：01：01相比在外显子3的碱基位置591出现突变（ C→T），密码子位置174由TCC→TCT，相应编码氨基酸是同义突变。结论 DNA测序结果表明该基因序列为新的MICA等位基因，已提交GenBank，并被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为MICA?008：05。
关键词： MICA 新等位基因 MICA?008：05 DNA测序分型 克隆测序 -
3种 DNA 甲基化定量分析方法的比较
目的：比较特定基因区域 DNA 甲基化检测方法的优缺点。方法采用焦磷酸测序、克隆测序和DNA 甲基化芯片等3种 DNA 甲基化检测方法，对7例唐氏综合征和5例正常对照样本的 PRDM8内含子7 CpG 岛中的部分序列进行甲基化检测。从准确度、重复性和精确度(分辨率)等方面来比较3种方法，探讨哪种方法更适合特定基因的 DNA 甲基化水平定量检测。结果①焦磷酸测序可在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平，结果重复性好，准确度高，而且能发现样本中 CpG 位点甲基化水平变化的规律；②克隆测序也可在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平，但结果重复性较差，无法发现 CpG 位点甲基化水平变化的规律；③甲基化芯片可通过所测区域的两个探针来判断样本间甲基化水平的差异，但无法在单碱基水平定量检测样本的甲基化水平；④上述3种方法检测结果之间存在一定的差异，但是样本间甲基化水平总体趋势基本一致。此外，唐氏综合征样本的甲基化水平高于正常对照样本。结论焦磷酸测序准确度高、重复性好、费用较低、操作较为简单快捷，更为适合在单碱基水平检测特定基因区域的 DNA 甲基化水平。
