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丙型肝炎病毒感染分子溯源技术研究进展
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染主要经血液和母婴垂直传播,还可能经性传播.依据美国疾病预防控制中心的有关指南,对HCV职业暴露感染的鉴定依赖于文件记录和定期的随访检测结果[1].对于没有完整记录和随访检测结果的职业暴露感染、医源性感染等,比如近年来多次在我国发现的聚集性丙肝疫情,单纯依靠传统流行病学调查难以确认真正的传染源和传播途径,这就需要利用更精细的分子溯源技术获得更直接的证据.本文对HCV分子溯源技术的原理、方法和应用作一综述.
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Miseq高通量测序平台用于一起疑似经性传播HIV的溯源调查
目的 建立分析HIV准种的Miseq高通量测序(简称Miseq测序)技术,并尝试用于一起疑似经性传播HIV的溯源调查.方法 采集疑似有传播关系的2例HIV感染者(编号P1、P2)血液样本,并以同一城市与他们无直接传播关系的2例HIV感染者(编号P3、P4)为对照.提取血浆中RNA,逆转录后进行HIV基因亚型分析和Miseq测序.根据测序结果分析样本中HIV的准种分布,比较使用优势准种数目由少到多(5、20、100、500、全部)时所得的基因离散率及系统进化树.结果 4份样本中HIV的基因亚型相同,均为HIV-1重组亚型(CRF) 01 _AE.采用Miseq测序,每份样本获得23 788～37 397条有效核酸序列,代表1 229～1 412个独特准种.P2与P1间的平均基因离散率(3.5％～4.5％)远小于与对照样本间(10.3％ ～ 19.6％,P＜0.01).系统进化树结果显示,P1和P2的准种聚集在一起,而P3和P4的各自单独聚为一簇;当所用的优势准种数目为20或更多时,P1对P2存在并系关系,提示HIV的传播方向是从P1到P2.结论 Miseq测序在HIV感染溯源调查中可以推断传播关系和传播方向,其操作较简便、检测成本较低,具有较高的实用价值.
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应用单基因组扩增法分析HIV-1准种基因变异
目的：探索应用单基因组扩增分析HIV-1准种基因变异。方法将深圳2010年6个基因测序出现重叠峰的样本RNA稀释至单拷贝，采用一步法RT-PCR套式扩增，扩增产物纯化后进行基因测序，应用Mega 4.02多功能基因分析软件分析不同准种序列的基因距离，构建进化树模型。同时，测定样本的CD4＋T淋巴细胞浓度和病毒载量。结果同一感染者体内HIV-1准种在进化树上形成了各自独立的簇，有些簇存在明显的亚簇，表明某些病毒株在复制中具有竞争优势。6个样本HIV准种的基因距离介于0.008与0.06之间，与感染持续时间和病毒载量有关。结论单基因组扩增法可以很好地分辨出HIV-1准种的基因变异，对于HIV-1准种基因距离的分析可以判断感染时间和分析免疫逃逸机制，其相关影响因素尚需更大样本的分析。
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马传染性贫血病毒白细胞弱毒疫苗株及其亲本毒驴强毒株前病毒基因组比较分析
为阐明马传染性贫血白细胞弱毒疫苗株(EIAVDLV)的致弱和免疫保护机理,对EIAVDLV121及其亲本驴强毒株(E1AVDV117)前病毒全基因组序列进行了测定,并结合准种理论,分析了EIAV疫苗致弱过程中基因组进化特点.利用LA-PCR技术对EIAVDV117和EIAVDLV121的前病毒基因组分两段进行扩增,分别获得4个和10个前病毒全基因组序列.EIAVDV117前病毒基因组平均为8 236bp,G+C含量38.0%.EIAVDLV121前病毒基因组平均8 249bp,G+C含量37.3%.两者的前病毒基因组平均差异率为2.8%.其中S2、LTR和env基因差异较大,分别为4.1%、3.9%和3.1%.此外,S2、S3和env推导的氨基酸的差异明显,分别为10.4%、5.6%和4.8%(gp90为6.8%).EIAVDLV121各基因的异质性均显著高于EIAVDV117.研究发现体外培养的EIAVDLV121至少有5种类型的LTR混合存在.在gp90推导的氨基酸序列上,EIAVDV117比EIAVDLV121平均多2个N-糖基化位点,总数为19,其中3个为EIAVDV117特有.EIAVDLV121有1个疫苗株特有N-糖基化位点.研究结果为进一步探讨马传染性贫血弱毒疫苗生物学特性提供信息.
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猪戊肝病毒存在准种现象
为研究猪戊肝病毒准种存在情况,采用逆转录-巢式聚合酶链反应法(RT-nested-PCR)对四株猪戊肝病毒(Hepatitis E virus)第2可读框(ORF2)部分序列进行PCR扩增,将产物克隆后,每个毒株分别随机挑取20个阳性克隆测序,进行DNA序列分析.结果显示4株HEV不同克隆间的ORF2核苷酸序列同源性分别为96.8%～99.7%、98.8%～99.7%、98.8%～99.7%和1o0%,有变异的克隆核苷酸序列与上海株(SAAS-JDY5)同源性为96.8%～1OO%.由此证实感染戊肝病毒的猪个体内存在HEV准种.
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四份中国HCV阳性血清中包膜蛋白E1/E2准种基因的序列分析及新型插入突变的发现
为分析四份中国丙型肝炎病毒(HCV)阳性血清中包膜蛋白E1/E2基因的准种特征.本研究对从4份中国HCV阳性血清(1b亚型:274、366和383；2a亚型:283)中提取的HCV核酸,采用逆转录-聚合酶反应扩增编码全长E1/E2蛋白(191～764aa)的基因片段,随机挑取多个克隆测序.根据E1/E2基因核苷酸的序列与其他相关序列(来自于GenBank)构建亲缘性关系进化树,进行核苷酸与氨基酸同源性分析并对重要的基因位点进行分析.共获得阳性克隆序列43个(274株10个,283株12个,366株13个,383株8个),发现高变区HVR1、HVR2的基因异质性高,而其他抗体中和表位及跨膜区I、Ⅱ及N末端糖基化位点相对保守.并首次发现在HCV 2a亚型(283血清)中多个准种序列存在1 279nt(E1区,313aa)处单碱基插入优势基因突变,导致HCV包膜蛋白编码突变与中断(E2区,398aa).本研究对中国HCV代表株包膜蛋白E1/E2编码基因的准种多样性及一种新型插入突变进行了描述,可为进一步研究HCV免疫逃避与慢性化机制提供重要信息.
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应用二代测序技术研究HIV准种进化的相关进展
近十年二代测序技术快速发展,与一代测序技术相比具有通量高、速度快、灵敏度高、准确率高等优点,主要以454焦磷酸测序、Illumina测序、Ion Torrent测序和SOLiD测序为代表.二代测序技术在HIV领域的研究已经越来越广泛,本文介绍了上述四种二代测序技术在HIV准种进化方面的应用.
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乙型肝炎病毒逆转录酶区基因序列准种与变异特点
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)P基因编码产物从功能上分为末端蛋白(1～178aa)、间隔区(179～336aa)、逆转录酶区(337～682aa)和RNA酶H区(683～816aa),各区有相应的生物学功能;逆转录酶区包含S基因主蛋白编码区.近年来的研究提出HBV感染者体内存在有准种[1,2]的假说.我们以逆转录酶区序列为研究靶区域,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶基因序列,随机选择克隆测序,比较其结果,证明了HBV准种特点的存在,并发现多种基因突变形式.
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早期HIV-1感染env基因的动态变异研究
目的 追踪观察HIV-1新发感染者体内CRF07_BC重组毒株膜蛋白基因的变异性.方法 从HIV-1感染者血浆中提取总RNA,通过逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)获得HIV-1 gp120全长及C2-C5区段基因.纯化后装入T载体,转化至Top10大肠埃希菌内增殖,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆,运用PCR方法进行鉴定,后对所获得的目的克隆测序.结果从两个感染者血浆样品中获得感染后半年到2年半间多个时间点的gp120基因克隆共135个及gp120基因C2-C5区段克隆15个,分析显示这些克隆均为HIV-1 CRF07_BC亚型.随感染时间的延长,HIV-1 env基因的离散率与多样性均有增加的趋势.env基因同义突变与非同义突变比较结果显示,C1、C3与V4区段非同义突变比率比gp120基因的其他区域都高.基因多态性分析的结果显示,同一时间点内不同毒株基因在不同区段的变异是不同的,基因多样性介于0与0.066±0.028之间.结论 随着患者感染时间的推移,HIV-1膜蛋白基因的变异逐渐增大.C1、C3和V4区的高突变率提示,该基因区可能是HIV-1病毒生存与宿主免疫压力相互作用的主要位点.
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HBsAg与抗-HBs同时阳性者HBV S基因准种分析
目的 分析HBsAg与抗-HBs同时阳性者体内乙型肝炎病毒(HBV)S基因准种分布及基因突变情况.方法 收集3例HBsAg与抗_HBs同时阳性者的血清和基本信息,提取HBV DNA,用PCR法扩增HBV S基因,将S基因克隆至载体,测序后通过软件分析准种序列差异、计算遗传距离分析进化选择压力.结果 1号样本感染的HBV为B2型,2号和3号为C5型;准种遗传进化分析发现1号同时存在两种优势病毒株,2号和3号只有一种优势病毒株;三者的信息熵水平无统计学差异;选择压力分析显示1号样本病毒种群的Ka＜Ks,ω=0.58,受到纯化选择压力;2号发生AAF134S、AAS143P置换突变,3号发生AAT125A置换突变和ntG494A、ntC500A无义突变.结论 HBsAg与抗_HBs同时阳性者S基因存在复杂的准种多样性;在准种中发现少量a抗原决定簇关键位点突变毒株,通过准种分析研究能真实地体现HBV生存状态.
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基于全基因组和准种序列分析3株HAV流行株基因特征
目的 分析3株甲肝病毒(hepatitis A virus,HAV)流行株全基因组和准种序列特征.方法 收集某地3例急性期甲肝患者血清标本,经病毒核酸提取、逆转录、分段巢式PCR,获得HAV近全长序列,并对全长VP1-2 A区进行克隆测序.结果 VP1-2 A连接区分型结果表明3株HAV均属于IA亚型,3株序列在此区核苷酸和氨基酸同源性为100％;全基因组核苷酸和氨基酸同源性分别为99.9％ ～ 100％和100％,与GenBank中日本AH2株同源性高(核苷酸、氨基酸同源性为98.5％和99.7％);在已发表的抗原中和位点处未出现氨基酸变异.每株流行株全长VP1-2 A区克隆序列内、以及所有克隆序列间,核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0％ ～ 100％、98.1％～100％和99.0％～100％、97.2％ ～ 100％,VP1-2 A连接区的核苷酸和氨基酸变异率高于部分VP1区.结论 3株流行株VP1-2 A连接区分型序列一致,全长基因组及准种序列间核苷酸、氨基酸序列同源性较高,推测可能为同源感染.本研究为甲肝病毒在传播过程中的遗传变异特点及溯源调查提供参考依据.
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丙型肝炎病毒准种多样性与病毒血症水平、疾病活动度及干扰素疗效的关系
目的了解丙型肝炎病毒(HCV)准种变异与病毒血症水平、疾病活动度及干扰素疗效的关系.方法采用针对HCV E2高变区1(HVR1)的单链构象多态性分析法(SSCP)对68例慢性丙型肝炎患者进行HCV准种检测,分析准种数目与HCV RNA、ALT、AST水平及肝组织活动指数(HAI)的相关性.对其中48例给予干扰素治疗,分析准种数目对干扰素应答效果的影响.结果 61例HVR1 SSCP阳性,HCV准种数目为(6.2±2.4)条.准种数量与HCV RNA水平显著相关(P<0.01),与ALT、AST及HAI无明显相关(P>0.05).干扰素治疗患者中,43例HVR1阳性,持续应答者治疗前HCV准种数量(3.3±1.2,n=11)显著少于获得治疗终点应答(ETR)伴复发者(6.3±2.2,n=12,P＜0.05)或无应答者(8.0±3.3,n=20,P<0.01).治疗结束时,干扰素组仍有16例检测出HCV准种,但准种条数降为(3.4±1.2)条,与未接受干扰素治疗病例的准种数目(6.8±2.5)相比差异有显著性,P<0.01),且其中10例准种模式发生了改变.结论 HCV准种多样性可引起较高的病毒血症水平,但与疾病活动度无关;准种数目可作为预测慢性丙型肝炎干扰素疗效的指标.
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河南地区HIV-1毒株Gag基因抗原表位变异特征及准种特点研究
目的 探讨中国河南地区人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)毒株GAG蛋白抗原表位变异特征,并对其准种特点加以分析.方法 套式聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增确认HIV阳性样本gagp17～p24基因区段并测序,PCR产物纯化后克隆,挑选克隆株鉴定为阳性后测序,以MEGA(version 3.0)等软件进行分析.结果 河南HIV毒株为B'亚型;gag基因p17区段抗原表位突变有E62G(55.80%),Y79F(48.90%),T84V(48.90%),144V(44.20%),gag基因p24区段抗原表位未见明显变异.结论 HIV-1 B'亚型毒株gag基因p17区段的4个抗原表位,存在较大变异,p24区段较为保守,适合抗原表位疫苗的研制.
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乙型肝炎病毒C基因启动子区准种与变异特点的研究
目的研究乙型肝炎病毒(HBV)C基因启动子区准种与变异的特点.方法以中国株HBV基因序列为依据,设计特异性聚合酶链反应(PCR)引物,自3例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV CP序列,克隆入pGEM Teasy质粒,随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度.结果测序结果发现HBV CP序列高度保守,但在TATA样盒(1～3)可发生多种突变,其中184 nt(T→C)位替换突变为常见;在直接重复序列(DR)Ⅰ上游存有一缺失突变高发区33.3%(5/15).结论 CP区内有一缺失高变区,TATA样盒3的变异可能影响前C蛋白的表达.结果提示HBV长期携带者体内有HBV准种共存.
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HCV准种多样性及其与临床关系的研究
目的了解丙型肝炎病人丙型肝炎病毒(HCV)准种感染情况及其与临床的关系。方法 采用针对HCV E2高变区1(HVR1)的单链构象多肽性分析法(SSCP)，对76例丙型肝炎患者血清HCV准种进行检测。结果 72例患者(94.7%)HVR1 PCR阳性，SSCP条带数为2～11条，平均5.8条。准种数目急性肝炎(3.1±1.2)<慢性肝炎(6.0±2.3)<肝硬化和/或原发性肝癌(8.4±4.3)(P<0.01)。经输血及静脉吸毒感染的丙型肝炎患者HCV准种数量显著多于经其他途径(散发)感染的丙型肝炎患者(P<0.05)。HCV1a、1b基因型感染者准种数量显著多于HCV2、3型感染者(P<0.05)。准种数目与HCV病毒血症水平显著相关(P<0.01)。结论 SSCP是一种简便、快速、可靠的HCV准种分析方法；HCV准种多样性与丙型肝炎的慢性化及疾病进展有关；感染时间长、基因1型感染及高水平的血清HCV RNA水平预示体内存在较多的HCV准种。
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母婴传播感染HBV儿童及其母亲体内HBV preS/S基因准种序列以及变异特点研究
目的对经母婴传播获得乙型肝炎病毒(HBV)感染子女及其母亲无症状携带者(AsC)体内HBV preS/S基因进行研究,了解来源相同的HBV毒株在不同程度病毒血症情况下preS/S有无准种存在及其特点. 方法应用T-A克隆技术构建重组质粒pGEM-preS/S、双酶切进行鉴定,每个病人选6个酶切鉴定正确的克隆测序并进行分析. 结果 3对AsC母子呈不同程度病毒血症,HBV均为基因型B/血清型adw2.36个克隆序列建立的进化树显示3对母子的preS/S为同一分支HBV preS/S进化而来,每例病人6个序列呈准种分布.低病毒血症HBV preS/S的核苷酸变异率明显高于高病毒血症,2个低病毒血症病人的变异位点绝大多数相同,其中错义变异多位于T-细胞表位和B-细胞表位内或/和附近.变异率和变异位点均与年龄无关. 结论经母婴传播而获得HBV感染儿童及其母亲无症状携带者,无论病毒血症高低,体内HBV preS/S序列均呈准种分布.来源相同的HBV preS/S在不同程度病毒血症病人体内差异较大,而与年龄无关.高病毒血症病人变异率低,而在低病毒血症变异率较高,但变异是有规律的,可能与免疫逃逸有关.
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丙型肝炎病毒包膜基因变异与急性丙型肝炎疾病转归的动态研究
目的 探讨HCV包膜基因变异与急性丙型肝炎疾病转归的关系.方法 前瞻性收集到5例HCV急性感染者的系列血清标本,其中2例一过性感染,3例持续性感染.采用高精确度DNA聚合酶,较长PCR扩增HCV基因组结构区(包括C区C端、E1和E2区N端)1 kb产物并进行克隆,每份标本挑选33个克隆,以异源双链和单链构象多态分析筛查的代表性克隆型DNA进行测序,并对HCV的E1、HVR1及HVR1除外的E2区核酸序列的非同义碱基替换率、同义碱基替换率以及氨基酸序列的理化特征进行分析.结果 HCV持续性感染者急性期与慢性期的标本比较,HVR1基因差异性明显大于E1(0.0322±0.0068 vs-0.0020±0.0014,P＜0.05)和HVR1以外的E2区(0.0322±0.0068 vs 0.0017±0.0011,P＜0.05),而一过性感染者感染初期与病毒清除前标本比较,HVR1、E1和HVR1以外E2基因差异性则无明显改变.HCV持续性感染者的E1(0.23×10-3±0.15×10-3)、HVR1(2.76×10-3±1.51×10-3)和HVR1以外E2区(0.50×10-3±0.10×10-3)的非同义碱基替换率比较,HVR1非同义碱基替换率呈明显增高趋势.相反,一过性感染者E1、HVR1和HVR1以外E2区的同义碱基替换率和非同义碱基替换率则无明显改变.E1、E2区所有半胱氨酸及潜在的糖基化天冬酰胺均高度保守,HVR1第11、25、27位置保持碱性氨基酸.结论 HCV持续感染与宿主免疫反应对HVR1的阳性选择相关,HVR1区特异位置保守的碱性氨基酸可供研制HCV疫苗时参考.
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HIV-1准种的变化与疾病进展关系的研究
目的研究HIV-1准种的变化对疾病进展的影响. 方法 PCR 方法扩增HIV-1 V3～V5区片段,采用HMA(异源双链泳动分析)的方法分析48例HIV/AIDS准种的变化,并结合HIV/AIDS CD4+ T淋巴细胞计数及病毒载量的结果分析HIV-1准种的变化对疾病进程的影响. 结果在不同的疾病状态下,体内病毒变异是不相同的,在体内CD4+ T淋巴细胞计数较高,血浆病毒载量低的个体内,病毒毒株有很强的变异特征,体内具有很高的准种复杂度;而在CD4+细胞数很低,病毒载量较高的个体,病毒基因变异较少,病毒准种较为单一. 结论 HIV-1准种的变化与疾病进展相关.
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丙型肝炎病毒传播分子流行病学诊断技术研究进展
丙型肝炎病毒( hepatitis C virus, HCV)感染是导致肝硬化和肝癌发生的主要病原体之一。 HCV的准种构成及病毒进化十分复杂,深入分析HCV准种构成是研究HCV传播机制的重要手段。 HCV 高变区( hypervariable region, HVR)是编码E1、E2/NS2的区域,该区域变异率很高,利用先进的测序技术和生物信息分析方法来分析HCV HVR准种构成,可深入了解HCV的传染来源、传播路径和进化程度。目前应用于HCV HVR准种分析的技术包括一代、二代和三代测序法及不同的生物学软件,国际上已广泛应用于HCV暴发调查溯源分析,尤其是医源性传播。当丙肝疫情发生时,通过新一代测序技术和生物学信息分析方法来进行病例溯源研究和传播路线分析,可为丙肝防控和治疗提供科学依据。
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丙型肝炎病毒包膜2区准种复杂性及其临床意义初探
目的研究丙型肝炎病毒(HCV)包膜2(E2)区准种复杂性及其临床意义。方法以9例不同血清丙氨酸转氨酶水平的急性HCV感染者和4例慢性丙型肝炎患者为对象，通过逆转录PCR扩增HCV E2区氨基端片段(560bp)，扩增产物直接克隆，以单链构象多态性(SSCP)/ 异质性双体(HD)分析对每份血清标本的30个克隆进行筛选及准种复杂性分析。结果慢性丙型肝炎患者血清HCV准种复杂性明显增高；HCV感染者血清ALT水平变化与准种复杂性无明显关系。结论 HCV E2区准种复杂性与病毒持续性感染有关，与肝损害程度无关。
