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应用单基因组扩增法分析HIV-1准种基因变异
目的：探索应用单基因组扩增分析HIV-1准种基因变异。方法将深圳2010年6个基因测序出现重叠峰的样本RNA稀释至单拷贝，采用一步法RT-PCR套式扩增，扩增产物纯化后进行基因测序，应用Mega 4.02多功能基因分析软件分析不同准种序列的基因距离，构建进化树模型。同时，测定样本的CD4＋T淋巴细胞浓度和病毒载量。结果同一感染者体内HIV-1准种在进化树上形成了各自独立的簇，有些簇存在明显的亚簇，表明某些病毒株在复制中具有竞争优势。6个样本HIV准种的基因距离介于0.008与0.06之间，与感染持续时间和病毒载量有关。结论单基因组扩增法可以很好地分辨出HIV-1准种的基因变异，对于HIV-1准种基因距离的分析可以判断感染时间和分析免疫逃逸机制，其相关影响因素尚需更大样本的分析。
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CD133+结直肠癌SW480细胞系克隆亚系的建立
目的 建立CD133+结直肠癌SW480细胞系克隆亚系.方法 通过有限稀释法进行单细胞克隆培养,从结直肠癌SW480细胞系48个单细胞孔中培养出8个单细胞源性细胞亚系(编号Y1～8).对所建立的细胞亚系进行RT-PCR、流式细胞分析及免疫细胞化学筛选CD133+的细胞亚系(Y6、Y2);并通过MTT法体外增殖实验、划痕实验、体外运动实验和皮下成瘤实验,比较CD133+之间及与CD133-单细胞源性细胞亚系的生物学特性.结果 筛选出CD133+单细胞源性细胞亚系2个(Y2、Y6),CD133-单细胞源性克隆6个(Y1、Y3、Y4、Y5、Y7、Y8).结论 通过单细胞克隆培养建立CD133+结直肠癌SW480细胞亚系,为下一步结直肠癌转移机制研究提供相关的单细胞源性细胞亚系.
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经典型霍奇金淋巴瘤中大细胞与小细胞亚系生物学特性比较
目的:探究经典型霍奇金淋巴瘤细胞系L428中大小细胞亚系生物学特性差异及其意义.方法:应用有限稀释法分离出L428中大小细胞亚系并进行传代培养,分别命名为L428-big和L428-small细胞.免疫细胞化学实验检测L428中大小细胞亚系CD15和CD30表达差异,MTT实验检测L428中大小细胞亚系增殖能力的差异;流式细胞术检测L428中大小细胞亚系的凋亡差异.结果:成功分离出L428细胞株中大小细胞亚系并进行传代培养;免疫组化显示L428-big细胞的CD15及CD30表达明显强于L428-small细胞;MTT实验显示,L428-big细胞和L428-small细胞之间增殖能力差异有统计学意义,F=565.273,P＜0.001,L428-small细胞增殖能力高于L428-big细胞,P＜0.001;流式细胞术显示,L428-big细胞的凋亡率为(3.3±0.1)％,明显多于L428-small细胞(0.4±0.1)％,P＜0.001.结论:L428-small细胞增殖能力强,凋亡少,为经典型霍奇金淋巴瘤细胞起源的进一步研究提供一定的实验基础.
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有限稀释法筛选轮状病毒LD9株纯化方法的建立及应用
目的:建立有限稀释法克隆纯化轮状病毒的试验方法,筛选出感染性强、遗传特性稳定的轮状病毒基因重配株LD9.方法:梯度稀释LD9毒种,用5个稀释度(10-4～10-8)的病毒感染铺满单层Vero细胞的96孔板细胞,培养6d,- 20℃冻融,培养物传代至24孔板继续培养6d,显微镜下观察细胞病变(CPE),- 20℃冻融后检测.以相同方法重复克隆纯化3次,筛选获得病毒滴度稳定、具有稳定遗传特性的纯化病毒,由T25、T75到2,4,10层细胞工厂逐级放大培养.结果:筛选出适用于疫苗生产用的遗传特性稳定、感染性强的LD9疫苗候选株.结论:建立了适用于轮状病毒克隆纯化的筛选方法.
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受体T淋巴细胞克隆的建立及其抗原特异性的检测
目的建立受体T淋巴细胞克隆后,进一步分析检测该克隆针对供体的抗原特异性.方法供体鼠脾细胞免疫受体鼠,再分离、纯化受体鼠T细胞,克隆受体T细胞.将动物分组免疫,对各组受体作电镜观察淋巴细胞超微结构、MTT法测定淋巴细胞增生试验以及流式细胞分析T细胞亚群的变化,分析检测该克隆针对供体的抗原特异性.结果①受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆稳定建立;②经免疫组的受体T细胞超微结构改变显著,淋巴细胞增生试验及流式细胞分析结果与对照组的差异有显著性意义(t＞t0.05).结论成熟T淋巴细胞,在一定条件下仍可发生分裂和增生,形成克隆.通过供体脾细胞抗原特异性刺激,检测证明终筛选出的T细胞克隆具有针对供体的抗原特异性.
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乙醛脱氢酶活性检测子宫内膜干细胞
背景:人子宫内膜中存在干细胞特性的细胞,但特异性标志物尚未找到,导致此类细胞很难被分离.目的:分析乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase,ALDH)活性检测能否分选出子宫内膜干细胞.方法:采用机械和酶消化相结合方法分离人子宫内膜细胞,用两次滤网方法分离出基质细胞和上皮细胞,根据乙醛脱氢酶活性采用流式细胞仪分选出ALDHhigh细胞和ALDHlow细胞,用有限稀释法培养细胞,观察细胞形态及生长特性;采用流式细胞仪鉴定细胞c-kit,CD90,CD73 及CD29 的表达.结果与结论:基质细胞中ALDH high细胞占(1.88±0.17)%,经过15 d的原代培养后,ALDHlow细胞克隆形成率达(1.06±0.34)%,ALDHhigh细胞克隆形成率达(4.50±0.82)%,ALDHhigh细胞集落形成率较ALDHlow细胞高(P< 0.05),同时ALDHhigh细胞大克隆数较ALDHlow高(P < 0.05) ;上皮细胞中未发现ALDHhigh细胞及克隆形成.子宫内膜集落形成细胞表现出c-kit、CD29、CD90、CD73 阳性.说明ALDH活性检测对子宫内膜干细胞有一定的分选作用.
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小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术
[目的]探讨小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F的再克隆技术.[方法]采用有限稀释法对已使用多年的小鼠腹水型肝癌高淋巴道转移瘤株Hca-F进行再克隆;615小鼠皮下接种,检测再克隆瘤株淋巴结转移能力.[结果]共分离出3个不同的瘤株,Hca-F-2-24c6,Hca-F-3-d4,Hca-F-3-a4,流式细胞仪检测证明3株瘤细胞均为单克隆细胞.动物实验证明三株瘤细胞淋巴结转移率分别为95.5% ,87% ,42.5%.[结论]有限稀释法操作简单,克隆的形成率高.
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用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞
制备单克隆抗体一个必不可少的步骤就是使融合后的细胞进行单克隆培养.融合细胞的克隆化方法主要采用有限稀释法[见:徐新来.细胞培养在杂交瘤技术中的应用.见:鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995:207～214].由于需要反复克隆再克隆,细胞培养的工作量大,操作繁琐,克隆效率低.我们采用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以往方法上的局限性,直接进行克隆化的培养,提高了工作效率.
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重组溶血素蛋白用于单增李斯特菌快速检测的效果
目的 制备单增李斯特菌的溶血素重组蛋白,获得溶血素的诊断用抗原和单克隆抗体.方法 以PCR法扩增单核细胞增多性李氏杆菌hly基因,构建原核表达载体,获得重组溶血素蛋白,免疫Balb/c小鼠,制备单克隆抗体.结果 运用杂交瘤技术成功得到3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株即2F5、5H1和8F9,并获得免疫球蛋白,测定2F5、5H1和8F9单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG3和IgGM.结论 本研究克隆和表达单增李斯特菌的hly基因,研制基于溶血素的诊断用抗原和单克隆抗体,为检验分析单增李斯特菌及制备基因工程疫苗奠定基础.
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两种方法纯化胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的结果比较
目的 利用有限稀释法和连续传代法纯化体外培养的神经干细胞(neural stemcells,NSCs),并对2种方法纯化后的细胞纯度及增生能力进行比较.方法 机械分离孕龄14.5 d的胎鼠脑室管膜下区细胞,利用有限稀释法和连续传代法纯化NSCs,通过免疫细胞化学法鉴定纯度(Nestin阳性卒)及分化细胞的类型.将2种方法纯化后的第3代NSCs以相同的密度接种后连续培养6周,每周进行细胞计数,绘制生长曲线.结果 有限稀释法和连续传代法纯化NSCs的Nestin阳性率均高于原代NSCs(31.00%±0.02%),有限稀释法的Nestin阳性率(91.00%±0.03%)高于连续传代法(58.80%±0.02%,P<0.05).有限稀释法纯化NSCs的生长曲线一直处于增生趋势,而连续传代法的细胞前3周是上升趋势,以后趋于平缓(P<0.05).结论 有限稀释法能有效纯化体外培养的NSCs,并保持细胞良好增生能力及多向分化潜能,为基因治疗视神经损伤疾病提供大量种子细胞.
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胶质母细胞瘤原代细胞单克隆株的建立
目的 建立胶质母细胞瘤原代细胞的单克隆株并观察记录不同单克隆株间细胞形态和增殖能力的差异.方法 胶质母细胞瘤组织原代培养后进行纯化、单克隆培养、鉴定;定期观察单克隆细胞株的生长状况和形态特征,并比较其增殖能力的差异.结果 成功建立了23株胶质母细胞瘤细胞单克隆株,根据单克隆株形态不同,将其分为长伪足型和短伪足型,长伪足型伪足长(142.50±33.65) μm,短伪足型伪足长(31.33 ±5.72) μm,两者伪足长短差异有统计学意义(P＜0.01);同时,细胞增殖实验证明长伪足型单克隆细胞株增殖能力弱于短伪足型单克隆细胞株,细胞计数试剂盒(CCK--8)实验显示长伪足型单克隆株第10天吸光度值为0.85 ±0.13,短伪足型单克隆株吸光度值为1.31 ±0.20,两者差异有统计学意义(P＜0.01).结论 不同单克隆细胞株形态和增殖能力的差异印证了肿瘤细胞的异质性.
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SRS淋巴瘤的SAC-ⅡB2克隆细胞株的生物学和诱导分化研究
目的和方法:SRS腹水瘤来源于本室建立的L6565病毒性白血病的胸腺悬液,移植成功率100%.继而应用SRS腹水瘤细胞在体外建成SRS-82细胞系.许菡等对SRS-82细胞采用有限稀释法,经过培养建立了SAC-ⅡB2克隆细胞株.经用抗淋巴细胞血清和多种单克隆抗体检测证明SRC-ⅡB2为无T,B细胞表面标记的淋巴干细胞.X-C生物学检测阳性,超薄切片在电镜下观察到A型和C型病毒颗粒.2×106个克隆细胞注射昆明种或SW-1系小鼠腹腔或皮下,可发生腹水瘤或实体瘤.结果:应用细胞诱导分化剂维甲酸(RA)的研究表明,在2×10-6～2×10-5 mol/L浓度作用下,分裂指数降低,并对SRS腹水瘤生长有明显抑制作用(P＜0.01),延迟荷瘤小鼠的生存期.免疫学和细胞化学方法研究显示,经RA处理的SAC-ⅡB2克隆细胞的ANAE阳性率和细胞内嘌呤核苷磷酸(PNP)活性均明显升高,而腺苷脱氨酶(ADA)活性显著下降,末端脱氧核苷酰转移酶(ADA)的表达有所减弱.结果提示RA对SAC-ⅡB2克隆细胞有一定程度的诱导分化作用.应用ABC免疫组织化学方法(郑颂国等1997),通过癌基因产物的单抗和多抗检测筛选,发现SAC-ⅡB2细胞有c-myc,c-fos的强阳性表达(+++)和c-jun, c-erbB, ras P21的弱阳性表达(+),严开平等(1997)针对c-fos cDNA第2～7编码序列设计合成18聚反义(AS)和正义(S)和无义(NS)的寡脱氧核苷酸,研究结果发现反义c-fos寡脱氧核苷酸可促使SAC-ⅡB2细胞形态向成熟阶段分化,抑制细胞增殖速度;免疫组化方法显示,克隆细胞中FOS蛋白表达下降.结论:反义c-fos寡脱氧核苷酸能特异地抑制小鼠淋巴瘤SAC-ⅡB2克隆细胞的恶性表型,并有诱导分化作用.
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利用异源性饲养细胞建立人抗原特异性T淋巴细胞克隆
目的 摸索利用有限稀释法建立抗原特异性T淋巴细胞克隆操作中的佳培养条件,并探讨利用异体来源的饲养细胞作为替代方案的可行性.方法 MTT法测定细胞增殖活性,判断T细胞生长的佳PHA、IL-2作用浓度以及用丝裂霉素处理法制作饲养细胞的浓度、时间条件,观察IL-4对克隆生长形态的影响.探讨异体饲养细胞进行有限稀释法T细胞克隆时的克隆生长特点和影响因素.结果 克隆时PHA 25 μg/ml、IL-2 27 u/ml,饲养细胞丝裂霉素处理60 μg/ml、80 min为比较理想的操作条件.IL-4可以促进CD4+细胞亚群的克隆生长,但异体饲养细胞法形成的T细胞克隆的抗原特异性难以保障.结论 IL-4对CD4+细胞克隆生长具有促进作用,异体饲养细胞法得到的T细胞克隆抗原特异性不高.
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疟原虫乳酸脱氢酶活性检测法和有限稀释法在筛选和建立恶性疟原虫克隆株时的应用
建立恶性疟原虫克隆株存在着两个技术难点:一是怎样对原虫感染率、原虫绝对数均小的标本进行疟原虫检测;二是怎样从一个疟原虫分离株中选择一个疟原虫.针对这两个问题,我所在建立恶性疟原虫克隆株过程中,检测微量疟原虫时采用乳酸脱氢酶活性检测法.在分离疟原虫个体时采用有限稀释法,对疟原虫高度且有限地稀释,以实现对疟原虫个体的分离,获得成功,为建立疟原虫克隆株奠定了基础.现报告如下:
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受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆的建立及其形成条件的比较研究
目的探索建立受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆,转入自杀基因诱导移植耐受的可行性.方法供体鼠脾细胞免疫受体鼠,再分离、纯化经供体鼠抗原刺激受体鼠T淋巴细胞,将其作有限稀释为单个T淋巴细胞,再分别以不同浓度饲养细胞、ConA、IL-2等条件,促使T淋巴细胞分裂、增殖,构建受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆.结果①受体针对供体抗原特异性T淋巴细胞克隆稳定建立; ②不同免疫组间克隆生成率的差异有显著性意义(t＞t0.05); 无或单纯饲养细胞孔无克隆生长; ConA刺激有少数克隆生成; 克隆生成率与IL-2刺激浓度可能相关.结论成熟T淋巴细胞,在一定条件下仍可发生分裂和增殖,形成克隆.通过供体脾细胞抗原特异性刺激,提示终筛选出的T淋巴细胞克隆具有针对供体抗原的免疫反应性.
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舌癌单细胞培养建系与癌干细胞相关标志的检测
目的 以舌癌Tca8113M1细胞系单细胞培养建系为基础,观察Tca8113M1细胞系中舌癌干细胞存在的现象及其相关标志的变化规律.方法 选取Tca8113M1细胞系,以有限稀释法进行体外单细胞培养并建立细胞亚系,在证实其成瘤性的基础上,进一步采用流式细胞术检测癌干细胞相关标志CD44、CD184、细胞外可溶性抗原(ESA)的表达情况,着重观察单个细胞培养形成细胞克隆的形态与时间.结果 以有限稀释法获取192个Tca8113M1舌癌单个细胞,在96孔板中进行体外培养,获取12个细胞亚系(获取比例为6.25％),均有高成瘤性.癌干细胞相关标志CD44-ESA均为高水平表达,而CD184表达则在12个细胞系之间有差异.在单个细胞培养中,形成完全克隆、部分克隆与旁克隆3种形态,12个细胞亚系均源于单个细胞形成的完全克隆,均可进行连续传代与扩增,而部分克隆与旁克隆则在后续培养中逐渐衰老与消亡.结论 Tca8113M1细胞系中可能存在癌干细胞,而单细胞培养可形成完全克隆并建立细胞亚系,是进行舌癌干细胞后续研究重要的细胞培养模式.
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系统性硬皮病患者皮肤成纤维细胞克隆与生长异质性
目的 分离系统性硬皮病(SSc)和正常皮肤成纤维细胞(FB)克隆,观察其形态和生长特性.方法 采用改良的有限稀释法分离SSc和正常皮肤FB克隆,光镜下观察克隆FB细胞形态,应用MTY法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期分布.结果 SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态均有异质性,主要分为细小梭形细胞、粗长梭形细胞和大多角形细胞3种.细胞形态呈大多角形的克隆增殖很慢,难以传代和冻存.与细胞形态呈细小梭形的克隆相比,呈粗长梭形的克隆增殖速度较慢,细胞倍增时间较长,G0/G1期细胞比例较高(P<0.05),S+G2/M期细胞比例较低(P<0.05).SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性经数次传代保持稳定.结论 SSc和正常皮肤克隆FB的细胞形态和生长特性均有异质性.
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有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究
目的 体外分离培养人牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)并进行鉴定.方法 采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验,鉴定所得细胞的增殖和分化能力.结果 分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形,克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势,体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化,具有干细胞增殖和多向分化的特性.结论 有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性.
