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诱导多能性干细胞与心肌细胞的融合细胞遗传表型特征研究
目的 体外构建诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)与心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的融合细胞,探讨其细胞遗传学以及定向分化等生物学特点.方法 iPSCs与原代心肌细胞通过聚乙二醇(PEG-4000)诱导融合,检测融合细胞染色体数分布情况,融合细胞碱性磷酸酶染色,鉴定亲本细胞特异性基因和蛋白在融合细胞中的表达情况,以及当融合细胞失去亲本心肌细胞表型时,其向心肌细胞分化的能力.结果 融合细胞表现为iPSCs样的特点;融合细胞主要表现为四倍体或者近似四倍体的核型(超过75%的融合细胞染色体数目在76~80条之间);碱性磷酸酶的阳性率低于同时间点的iPSCs;干细胞特异性基因Oct-4和Nanog的表达量在融合细胞与iPSCs中没有差异,而心肌细胞特异性基因α-MHC和β-MHC在融合细胞中的表达量明显低于心肌细胞;Oct-4蛋白在不同代数的融合细胞中均有表达,而随着时间的延长,cTnT蛋白逐渐呈阴性表达;失去亲本心肌细胞表型的融合细胞能够向心肌细胞分化,且分化率高于同时间点的iPSCs.结论 iPSCs与原代心肌细胞的融合细胞,初期表现出双向重建,P5代后完全表现出干细胞显型,并且能向心肌细胞分化.
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人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合研究
目的探讨用杂交瘤技术制备树突状细胞疫苗的方法.研究树突状细胞/肿瘤细胞之融合细胞的形态及表型特征. 方法用PEG法将免疫磁珠法分离获得的人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞株LTEP78融合,瑞氏-姬姆萨染色观察树突状细胞、LTEP78细胞及其融合细胞的形态结构,SP免疫细胞化学染色法检测融合细胞的分子表达. 结果分离的树突状细胞能高表达HLA-DR分子,而LTEP78细胞则不表达;将树突状细胞与LTEP78细胞按10∶1比例融合后,两者的细胞膜、细胞质依次融合,获得的融合细胞仍能表达HLA-DR分子. 结论人树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合是一个动态过程,通过将两者融合,人肺癌细胞获得了人树突状细胞表达的HLA-DR分子,从而增强了其免疫原性,为人树突状细胞疫苗的研制奠定了基础.
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肝癌细胞H22与树突状细胞杂交瘤苗的实验研究
目的:将肝癌H22细胞与树突状细胞(DC)相融合,研制杂交瘤苗,并观察瘤苗的生长特性、致瘤性及免疫活性.方法:将DC与肝癌H22细胞融合制备Hz2-DC融合细胞,磁式分选器分选融合细胞;观察融合细胞的生长特性和体内致瘤性;从Balb/C小鼠皮下接种融合细胞,实验设肿瘤等三组对照,每组各5只小鼠.MTT比色法检测小鼠脾CTL活性.结果:融合细胞在体外能分裂增生,但明显低于肿瘤细胞,无体内致瘤性;活融合细胞免疫的小鼠,其脾CTL杀伤H22细胞的活性明显高于对照组小鼠(P＜0.01).结论:融合细胞能诱导出特异性的CTL活性,可望成为肝癌免疫治疗的新途径.
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肝癌患者树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肝癌免疫
目的:探讨肝癌(HCC)患者树突状细胞(DC)融合HCC细胞体外诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫的效能.方法:应用人重组粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和白介素-4(rhIL-4)对肝癌患者外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HepG2,MTT法测定融合细胞(HepG2/DC)刺激同源T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性试验检测HepG2/DC诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对HepG2的特异性杀伤作用.结果:体外培养1 wk后的DC高度表达CDh,HLA-DR,CD54,CD80和CD86,融合细胞HepG2/DC刺激同源T淋巴细胞增值能力显著高于HepG2,HepG2+DC,DC及PBS,A值分别为0.816±0.019,0.541±0.020,0.632±0.018,0.564±0.018,0.345±0.013(P＜0.05),HepG2/DC活化的CTL对HepG2具有明显的特异性杀伤作用.结论:HCC患者外周血DC融合HCC细胞可有效诱导同源T淋巴细胞产生特异性抗HCC免疫,可望成为一条HCC免疫治疗的有效途径.
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人树突状细胞与肝癌细胞系HLE融合细胞的构建
目的构建人源树突状细胞(DC)与肝癌细胞系HLE的融合细胞.方法含15%FCS的RPMI 1640培养HLE细胞, 用GM-CSF和IL-4培养成人外周血单核细胞7 d, 并用TNF-α和PGE2促成熟2 d后获得成熟DC; 用荧光染料PKH67-GL(绿色荧光)和PKH26-GL(红色荧光)分别标记DC和HLE细胞,以50%聚乙二醇和10%二甲基亚砜为融合剂,构建可供流式细胞仪快速筛选的融合细胞.结果成功构建具有红、绿双色荧光的人源DC与HLE的融合细胞, 融合率为16.8%.结论利用PKH67-GL和PKH26-GL为标记,可获得便于快速识别和筛选的DC与肝癌细胞的融合细胞,为使用融合DC疫苗治疗肝癌奠定了基础.
关键词： 人树突状细胞 肝癌细胞系HLE细胞 融合细胞 -
自杀性肿瘤疫苗对大鼠卵巢癌的治疗作用及其安全性研究
目的 将自杀基因修饰的卵巢癌细胞与树突状细胞(DC)融合制备成自杀性肿瘤疫苗(FC/TK),观察FC/TK对大鼠卵巢癌的免疫治疗作用,并探讨对FC/TK进行体内灭活的可行性.方法 以聚乙二醇法,用大鼠骨髓来源的DC与转导有自杀基因(HSV1-TK基因)的大鼠卵巢癌上皮细胞株NuTu-19细胞融合制备成FC/TK,在扫描电镜下观察FC/TK的形态;用3H-TdR渗入法,检测FC/TK刺激T细胞增殖的能力.在大鼠体内的免疫治疗实验中,以FC/TK治疗大鼠卵巢癌皮下瘤,观察肿瘤形成及肿瘤大小,分别设立经60Co照射的FC/TK组、未经自杀基因修饰的卵巢癌细胞与DC融合的疫苗(FC)组和PBS对照组.在体内灭活实验中,将FC/TK以荧光染料标记后进行大鼠体内示踪,腹腔注射羟甲基无环鸟苷(GCV)7 d后,采用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的d-UTP缺口末端标记技术,对大鼠淋巴组织的冰冻切片做原位细胞凋亡检测.结果 FC/TK为多形性,扫描电镜下可见不规则的突起.与对照组相比,FC/TK能明显刺激T细胞增殖(P＜0.01).大鼠体内的免疫治疗实验结果显示,FC/TK组与FC组大鼠的成瘤时间晚于经60Co照射的FC/TK组(P＜0.05),较PBS组明显延迟(P＜0.01);接种NuTu-19细胞90d后,FC/TK组大鼠的平均肿瘤体积较经60Co照射的FC/TK组和PBS组明显缩小(P＜0.01),但FC/TK组与FC组之间,差异无统计学意义(P＞0.01).荧光显微镜下,经红色荧光标记的FC/TK出现在大鼠脾脏;进一步TUNEL染色显示,经GCV处理后,进入大鼠体内的FC/TK已发生凋亡.结论 FC/TK对大鼠卵巢癌有免疫治疗作用,并可由自杀基因系统控制其在体内的存活.
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胶质瘤树突状细胞融合疫苗诱导抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞
在本研究中,我们检测树突状细胞(DC)与胶质瘤细胞U87融合是否会产生融合细胞,并确定此融合细胞是否会于体外诱导产生胶质瘤细胞U87特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL).
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卵巢癌细胞和脐血树突状细胞融合瘤苗的体外培养与免疫原性的研究
目的 将脐血来源的树突状细胞(DC)与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞相融合,获得SKOV3/DC融合细胞,分析其生物学特性及其免疫原性.方法 ①利用PKH26红色荧光染料标记脐血来源的DC,用聚乙二醇法(PEG)融合DC与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,用流式细胞仪分选融合细胞(SKOV3/DC).②应用细胞培养技术、流式细胞术及光学显微镜检测SKOV3/DC的生长特性和形态学特征,并分析其免疫原性.结果 ①脐血来源的单核细胞(Mo)在相关细胞因子的作用下,可诱导分化为DC,其可表达表面抗原CD1a、CD80、CD86、HLA-DR及MHC-Ⅰ,不表达CA125.②人卵巢癌细胞株SKOV3细胞为CA125及MHC-Ⅰ双阳性细胞,不表达CD1a、CD80 、CD86和HLA-DR分子.③树突状细胞和SKOV3按10∶ 1比例融合,融合率约为8.5%.SKOV3/DC形态与亲本肿瘤细胞相似,CA125抗原表达呈阳性,并且高表达CD1a、CD80、CD86、HLA-DR和MHC-Ⅰ分子.SKOV3/DC在体外能分裂增殖,但增殖活性明显低于SKOV3细胞.结论 ①脐血中的DC前体细胞(单核细胞)可在体外分化扩增为成熟的功能性DC.②SKOV3/DC融合细胞兼具两种亲本细胞的部分特性,但其体外增殖活性明显降低,失去亲本肿瘤的恶性生长特性.本研究为将SKOV3/DC作为肿瘤疫苗用于卵巢癌主动免疫治疗的研究提供了前期资料.
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卵巢癌细胞和脐血树突状细胞融合瘤苗抗肿瘤免疫效应的初步研究
目的:将脐血来源的树突状细胞(DC)与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞相融合,获得SKOV3/DC融合细胞,分析其生物学特性及体外诱导抗卵巢癌肿瘤免疫的能力.方法:1)将用PKH26红色荧光染料标记脐血来源的DC后,聚乙二醇法(PEG)融合DC与人卵巢癌细胞株SKOV3细胞,流式细胞仪分选融合细胞.2)应用细胞培养技术、流式细胞术及光学显微镜检测SKOV3/DC的生长特性和形态学特征;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察融合细胞体外刺激混合淋巴细胞反应的能力及诱导特异性肿瘤免疫的能力.结果:1)DC和SKOV3按10∶1比例融合,融合率约为8.5%.融合细胞可在体外缓慢增殖,CA125抗原及CD1a、CD80、CD86、HLA-DR、MHC-Ⅰ分子表达阳性.2)SKOV3/DC在体外能有效的激发混合淋巴细胞增殖反应,可明显激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL),对卵巢癌细胞株SKOV3有特异性杀伤效应.结论:利用PEG法制备的SKOV3/DC融合细胞兼具两种亲本细胞的部分特性,在体外能够诱导特异性抗肿瘤免疫.本研究将SKOV3/DC作为肿瘤疫苗,为其在卵巢癌主动免疫治疗研究中的进一步应用打下了基础.
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用甲基纤维素半固体培养基筛选杂交瘤细胞
制备单克隆抗体一个必不可少的步骤就是使融合后的细胞进行单克隆培养.融合细胞的克隆化方法主要采用有限稀释法[见:徐新来.细胞培养在杂交瘤技术中的应用.见:鄂征主编.组织培养和分子细胞学技术.北京:北京出版社,1995:207～214].由于需要反复克隆再克隆,细胞培养的工作量大,操作繁琐,克隆效率低.我们采用甲基纤维素制成半固体培养基可以克服以往方法上的局限性,直接进行克隆化的培养,提高了工作效率.
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人外周血树突状细胞-乳腺癌细胞融合细胞
目的:探讨树突状细胞-肿瘤细胞融合细胞的形态特性,为研制融合细胞疫苗提供形态学依据.方法:将免疫磁珠法分离的人外周血树突状细胞与人乳腺癌细胞株MCF7融合,瑞氏-姬姆萨染色观察;扫描电镜观察树突状细胞、融合细胞的表面超微结构.结果:树突状细胞与MCF7细胞按10:1比例融合后,一个乳腺癌细胞可以与一个或多个树突状细胞相融合;扫描电镜下可见分离的树突状细胞表面有突起,树突状细胞/MCF7融合细胞具两种亲代细胞的表面超微结构特点.结论:树突状细胞与人乳腺癌细胞融合后无明显的形态改变.
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DC/肿瘤融合细胞疫苗制备规范化研究
树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前所发现的功能强的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),在激活静息T细胞产生抗肿瘤反应方面发挥着重要的作用[1-3] .正因为如此,DC肿瘤疫苗的研究和应用倍受人们的关注,其中一种新型的DC肿瘤疫苗引发了研究者们的极大兴趣--DC/肿瘤融合细胞疫苗,其既表达肿瘤的所有抗原成分,又具有DC特殊的抗原提呈能力.
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DC融合瘤苗治疗大鼠腹腔播散性卵巢癌
目的:研究树突状细胞(DC)与卵巢癌融合的融合瘤苗对大鼠腹腔播散性卵巢癌的治疗作用,并观察其体内应用的安全性.方法:用聚乙二醇法将Fischer344(F344)大鼠骨髓来源的DC与卵巢癌上皮细胞株NuTu-19细胞在体外融合制备融合瘤苗(DC-NuTu-19).流式细胞术检测DC-NuTu-19的免疫相关表型.将DC-NuTu-19接种于F344大鼠皮下,观察它在体内的成瘤性.用乳酸脱氢酶释放法检测经过DC-NuTu-19免疫的大鼠脾细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对NuTu-19细胞的杀伤作用.复制腹腔播散性卵巢癌的F344大鼠模型,观察DC-NuTu-19对它的治疗作用.结果:DC-NuTu-19高表达主要组织相容性复合物-II(MHC-II)分子OX6、共刺激分子B7-2、细胞间粘附分子ICAM-1和大鼠DC的标志性抗原整合素OX62.与NuTu-19相比,DC-NuTu-19在大鼠体内成瘤率降低,成瘤时间延迟,两组平均瘤重具有统计学差异(P<0.05).经DC-NuTu-19免疫的大鼠脾CTL对NuTu-19细胞的杀伤活性显著增高(P<0.01).与对照组相比,经DC-NuTu-19治疗后大鼠的病情发展速度减缓,生存期明显延长(P<0.01).结论:卵巢癌DC融合瘤苗能显著提高大鼠CTL杀伤活性,诱导高效而特异的抗卵巢癌免疫效应,延长患有腹腔播散性卵巢癌大鼠的生存时间.
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肾综合征出血热患者尿融合细胞内病毒G区基因及其蛋白表达
目的:研究肾综合征出血热(HFRS)患者尿融合细胞内汉坦病毒(HV)G区靶基因(膜蛋白基因)RNA、mRNA的定位和HV膜蛋白在尿融合细胞中的表达定位.方法:设计针对病毒M片段G基因区的探针,地高辛素标记,运用核酸原位杂交技术检测靶基因RNA和mRNA在尿融合细胞中的定位.同时用SABC免疫组化法检测病毒膜蛋白在尿融合细胞中的表达定位.结果:病毒靶RNA和mRNA检出于细胞核和细胞浆.21例中,14例阳性,阳性率66.6%(14/21),其中核型9例,核浆混合型5例.病毒膜蛋白检测,21例中16例阳性,阳性率76.2%(16/21),病毒膜蛋白表达见于细胞膜.两者阳性率相比较差异无显著性(P＞0.05).结论:HFRS病毒膜蛋白的表达与病毒编码该蛋白的G基因区RNA、mRNA均可在患者尿融合细胞内检出.
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人卵巢癌细胞与自体或同种异体树突状细胞融合诱导抗肿瘤免疫
目的探讨人卵巢癌(OVCA)细胞与自体或同种异体树突状细胞(DC)融合后体外诱导特异性CTL的作用.方法用PEG法将OVCA细胞与自体或异体DC融合,在含GM-CSF的RPNH-1640完全培养基中继续培养7～14d,然后将融合细胞与CA-125特异性T细胞共同培养,用细胞内细胞素染色法检测其诱导CTL活性.结果人类OVCA细胞表达CA-125、HER2A/neu、MUC1肿瘤相关抗原及MHC-Ⅰ类分子和粘附分子(ICAM),但不表达MHC-Ⅱ类分子、B7-1和B7-2;DC则表达MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子、共刺激分子和ICAM,但不表达DF3/MUC1或CA-125等OVCA相关抗原,而OVCA细胞与自体或异体DC融合细胞则表达CA-125及MUC1肿瘤相关抗原、MHC-Ⅰ类和Ⅱ类分子、B7-1、B7-2及ICAM.结论人OVCA与自体或异体DC融合细胞能诱导由MHC-Ⅰ类分子限制的CTL活性和自体肿瘤细胞的溶解作用.
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抗艾滋病复制周期药物研究的新进展
艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS),是由人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起的,目前尚无预防疫苗、又无有效治疗办法且病死率极高的传染性疾病.HIV病毒通过进攻细胞、融合细胞、逆转录、整合、转录、转译、组合成新病毒并溢出的一系列过程进行复制,从而对人体构成损害.针对HIV复制周期的药物研究已经取得了一定的进展,虽然目前已有多种药物应用于临床,但是寻求新的、高效且廉价的抗艾滋病药物是全世界,特别是发展中国家的重要工作.以下就研究中的逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、整合酶抑制剂和融合酶抑制剂等化学合成药物做一综述.
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辐照剂量对肿瘤细胞活性及肿瘤融合细胞疫苗效果的影响
目的 探讨制备融合细胞疫苗过程中,肿瘤细胞的佳辐照剂量,并研究不同辐照剂量下融合细胞疫苗的抗肿瘤效果.方法 利用RS2000生物学X射线辐照仪产生不同剂量的X射线,以鼠肝癌细胞系BNL 1ME a.7R.1(MEAR)细胞为材料,研究辐照剂量与肿瘤细胞增殖活性之间的关系;采用流式细胞术检测不同辐照剂量下融合细胞疫苗的抗肿瘤效果.结果 高剂量辐照所致的肿瘤细胞增殖活性比低剂量辐照所致的肿瘤细胞增殖活性低,肿瘤融合细胞疫苗抗肿瘤效果具有辐照剂量依赖性.结论 制备融合细胞疫苗时,对肿瘤细胞进行辐照应适当考虑辐照剂量对细胞增殖活性的影响,以得到佳辐照效果,从而确保融合细胞疫苗的安全高效.
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诱导多能干细胞/原代心肌细胞的融合细胞表现出双向重建
目的 体外构建诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSc)与原代心肌细胞的融合细胞,初步探讨融合细胞体外生物学特性.方法 绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)转染八聚体结合转录因子4(octamerbinding transcription factor-4,Oct-4)小鼠来源的iPSc与小鼠乳鼠心肌细胞通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG-4000)诱导融合,建立细胞融合模型.动态观察融合细胞生长形态变化情况,融合细胞碱性磷酸酶( alkali phosphatase,AKP)染色,免疫荧光鉴定融合细胞表达干细胞与心肌细胞特异性蛋白情况,以及染色体核型分析,确定融合细胞是否发生细胞核的融合及程度.结果 聚乙二醇( PEG-4000)能够介导iPSc与心肌细胞融合,融合后第4天开始出现成集落状生长的细胞团；第2、3、4、5天的iPSc和融合细胞AKP阳性率分别为(0.935±0.039)、(0.939±0.022)、(0.954 +0.017)、(0.944±0.027)和(0.761±0.044)、(0.740±0.023)、(0.681±0.034)、(0.748±0.045),同时间点的iPSc和融合细胞AKP阳性率比较有明显差异(P＜0.05)；融合细胞初期主要表现为iPSc的特点,Oct-4表达阳性,cTnT表达阴性,融合7d后,逐渐表现出两种细胞的特点,Oct-4与cTnT均表达阳性；超过80％的杂交细胞染色体数目在76 ～ 80条之间.结论 二倍体iPSc与二倍体心肌细胞的融合细胞,具有两亲本细胞的特性,表现出双向重建.
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人树突状融合细胞诱导体外抗脑胶质瘤活性的研究
背景与目的:树突状融合细胞疫苗作为一种有效的抗原提呈细胞在癌症治疗上很有前景,但应用于人脑胶质瘤治疗的尝试仍不多,在国内仍是空白.本实验使用人脑胶质瘤细胞T98G和胶质瘤患者的外周血PBMC诱导的DC融合制备DC-肿瘤融合细胞(FC),并研究其体外诱导的抗胶质瘤活性.方法:采用PEG法进行细胞融合,采用混合淋巴细胞反应和乳酸脱氢酶法(LDH)释放法来分别评价FC刺激T淋巴细胞增殖能力和FC致敏的T淋巴细胞对T98G的杀伤能力.结果:建立了DC-人脑胶质瘤融合细胞(FC)的制备方法,经过1.5Gy照射的FC致敏患者外周血T细胞,对T98G的杀伤明显高于仅用单纯DC或T98G致敏的T细胞(P＜0.01),而且杀伤T98G的能力随E/T比率的增加而由20%上升到88%,但对MCF-7的杀伤仅在10%左右,显著低于对T98G的杀伤(P＜0.01).同时致敏的T细胞在负载T98G裂解物(1ysate)的自体DC的刺激下引起的增殖高于仅用单纯DC或T98G致敏的T细胞,具有显著性差异(P＜0.05);对于已经致敏的T淋巴细胞,负载lysate的自体DC所引起的T细胞增殖明显高于自体DC或lysate的作用(P＜0.01).结论:本实验所制备的FC经过1.5 Gv照射后可以有效致敏患者外周血T细胞,并在负载抗原的DC的刺激下可以在体外扩增,致敏的患者外周血T淋巴细胞是可以进行特异性杀伤的CTL,杀伤能力随效靶比增高而上升.本实验结果为将FC应用于人脑胶质瘤临床治疗提供了实验依据.
