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干细胞向生殖细胞分化的研究进展
干细胞(SCs)具有在体外分化为生殖细胞的潜能,为研究生殖细胞(GCs)早期发育提供了良好的模型,并将为干细胞移植修复生殖功能提供细胞资源.本文综述了胚胎干细胞/诱导多能干细胞(ESCs/iPSCs)、新生儿附属物来源干细胞(NDSCs)以及成体干细胞(ASCs)向生殖细胞分化所取得的研究进展,同时总结了各类干细胞向生殖细胞分化时所遇到的障碍及所面临的挑战,为干细胞在生殖医学领域的应用提供理论依据.
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莫信干细胞“神话”
干细胞研究是近年来医学前沿的重点发展领域.追随干细胞研究的热潮,许多与干细胞相关的抗衰老等内容充斥各类商家和媒体,给予人们无尽的想象空间.然而,在这些动听的“神话”故事中,虚妄常常多过真实.研究报道,干细胞是一类具有多向分化潜能的细胞,具有分化并再生各种组织、器官的潜在能力,就像树干能不断生长出新的枝叶一样.无论心肝脾肺肾,还是神经、血液,理论上都能由干细胞分化生成.干细胞有着一个大家族,其中胚胎干细胞具有分化成各种细胞组织的能力;成体干细胞则只能分化成特定的几种组织细胞,如脂肪干细胞可以分化为脂肪、骨和软骨,神经干细胞可生成神经细胞.换而言之,并非每一种干细胞都是“万能”的.
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干细胞研究
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞.它具有自我更新能力(Self-renewing),能够产生高度分化的功能细胞.干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞.在胚胎的发生发育中,单个受精卵可以分裂发育为多细胞的组织或器官.在成年动物中,正常的生理代谢或病理损伤也会引起组织或器官的修复再生.胚胎的分化形成和成年组织的再生是干细胞进一步分化的结果.胚胎干细胞是全能的,具有分化为几乎全部组织和器官的能力.而成年组织或器官内的干细胞一般认为具有组织特异性,只能分化成特定的细胞或组织.
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FGFR2异构体及相关剪接因子在人胚胎干细胞和成体干细胞中的表达
目的 比较FGFR2异构体及其剪接因子在人胚胎干细胞(hESCs)及其分化的拟胚体(EBs),以及骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪间充质干细胞(ADSCs)和毛囊干细胞(HFSCs)等不同组织来源成体干细胞(ASCs)中的表达.方法 用RT-PCR、免疫荧光染色和流式细胞仪分析鉴定hESCs、EBs和ASCs的生物学特性;用real-time PCR比较FGFR2异构体Ⅲb、Ⅲc及相关剪接因子的表达.结果 FGFR2的选择性剪接在hESCs、EBs和ASCs中均以Ⅲc为主.hESCs向EBs分化后,Ⅲb和Ⅲc的表达及Ⅲb/Ⅲc比值均升高,EBs中抑制Ⅲc表达的剪接因子FOX2和抑制Ⅲb表达的剪接因子HnRNPA1分别在分化第7天和第14天表达升高(P＜0.05).FGFR2异构体在hESCs与HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.01),在BMSCs中的表达水平显著高于在ADSCs中(P＜0.05).多种FGFR2相关剪接因子在hESCs和HFSCs中的表达水平显著高于在BMSCs和ADSCs中(P＜0.05).结论 FGFR2异构体及其相关剪接因子在不同分化阶段和组织来源的干细胞中有不同的表达谱.
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2.8大鼠成体干细胞食管下段移植的实验研究--一种可能治疗胃食管反流病的新方法
目的GERD是一种常见的消化道疾病.目前治疗GERD的主要方法是:①改变生活方式;②药物治疗;③外科手术治疗;④内镜治疗.虽然上述方法都有一定的治疗效果,但也都存在一定不足,因此迫切需要探索一种彻底有效的治疗方法.研究成体干细胞(骨骼肌卫星细胞和骨髓间充质干细胞)注射到食管下段的可行性,探索利用成体干细胞移植治疗GERD的新方法.
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应用成体干细胞临床治疗神经系统疾病——极具转换医学研究价值的领域
神经系统疾病是威胁人类生活质量的重大疾病,干细胞尤其是成体干细胞的研究推动了针对此类疾病生物治疗医学的发展.相关的基础与临床研究显示出令人欣慰的治疗前景,有望成为某些难治性中枢神经系统疾病的临床治疗手段.因此应当大力加强基础与临床研究之间的密切协作,促进干细胞移植治疗早日进入临床,为广大神经系统疾病患者服务.转换医学是架起基础医学和临床医学的桥梁和纽带,依靠转换医学的纽带作用将会促进这一领域的快速发展,具有重要的研究价值.
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干细胞基础研究的新进展
近5年来,在世界范围出现干细胞的研究热潮,有关干细胞的论文大量发表,风起云涌.然而,有部分的实验结论缺乏充足的证据,而引起质疑.例如干细胞"横向分化"的假设错误地认为干细胞可以跨胚层、跨系别地任意地变身,脂肪变肝脏,肌肉变神经等等.成体干细胞的存在是21世纪一个伟大的科学发现.越来越多的实验证明成体组织中还存在胚胎发育过程遗留下的各个胚层的干细胞和各类组织干细胞.全身各类组织中的成体干细胞含有除了生殖干细胞外的各种干细胞.至今,只有在生殖组织中才能发现生殖干细胞,因而生殖组织以外的成体干细胞又称为亚全能干细胞.成体干细胞包括造血和非造血的干细胞,非造血的干细胞又包括了各种非造血组织的干细胞,例如神经干细胞和间充质干细胞等.间充质干细胞是全身结缔组织(骨、软骨、肌肉、脂肪、纤维、血管等)的干细胞,它是创伤、烧伤、缺血坏死、骨髓损伤等修复过程中所必不可少的,有巨大的临床应用前景.随着生命科学的全面发展,干细胞领域中的认识误区将逐步得到澄清,干细胞科学也必将健康地发展起来.
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成体干细胞
在胎儿、儿童和成人组织中存在的多潜能干细胞统称成体干细胞.成体干细胞具有自我更新的能力,并且可以分化成与其来源不同的其他组织类型的细胞.一种组织来源的干细胞可分化成各种类型的细胞,即干细胞可塑性.成体干细胞可塑性是成体干细胞应用于临床的基础,但对干细胞可塑性机制的认识学术界仍存在较大的争议,先后有学者提出脱分化、异质细胞群体和细胞融合等学说,但都不能完全解释成体干细胞的可塑性.近年来的研究提示,成体组织中存在多潜能干细胞,我们发现在胚胎发育后的多种组织中都存在一类原始干细胞群体,在体内、外的特殊环境下,这类原始干细胞可分化为不同胚层的组织细胞,我们称其为亚全能干细胞.亚全能干细胞是存在于人体多种组织中的分化潜能介于从人体胚胎干细胞逐渐形成组织多能干细胞的发育过程中的一种原始干细胞亚群.
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皮肤干细胞的生物学特点与应用研究
随着对成体干细胞研究的深入,发现皮肤中至少含有6种成体干细胞.本文着重介绍目前研究取得结果较多的表皮干细胞和真皮多能干细胞,包括目前已知的其各自的生物学特性和鉴别等.同时,对皮肤干细胞在组织工程(皮肤、牙齿)、创伤修复、基因研究及遗传性疾病的治疗等方面的应用作一简要综述,为其将来的应用提供参考.简单介绍对皮肤中几种成体干细胞的基础研究和分离纯化技术的进展,可望进一步加深对皮肤自身生物学特点和机制的了解以及为临床应用等方面开拓广阔的前景.
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人类脂肪来源成体干细胞体外定向成软骨的诱导实验
目的 评价人类脂肪来源成体干细胞(hADASc)体外培养转基因定向成软骨诱导的可行性.方法 hADASc体外培养后行PGL3.转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染并鉴定,检测转染细胞Lueiferase活性相对光读数(RLU),再行反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测和抗Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(实验组:转染的hADASc,同比对照组:加入软骨细胞定向诱导培养基的未转染hADASc;阴性对照组:未转染的hADASc),自动图像分析系统分析免疫染色图片并计算阳性颗粒(PU)值.结果 人类皮下脂肪体外分离培养出具有干细胞特征的有核组织细胞.hADASc转染后,实验组测得RLU值(9 212.583±315.240)高于阴性对照组(317.000±20.710,P＜0.01).RT-PCR结果显示转染的hADASc表达TGF-β1;免疫染色结果显示,实验组与同比对照组呈阳性反应,且两组PU值(13.864±2.416,13.637±2.548)均与阴性对照组的PU值差异有统计学意义(6.013±0.827,P＜0.05).结论 人类皮下脂肪体外分离培养出具有干细胞特征的有核组织细胞.PGL3-TGF-β1基因转染的hADASc可表达TGF-β1.内源性TGF-β1可诱导hADASc分泌Ⅱ型胶原蛋白,与外源性TGF-β1作用相类似.
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人脐带基质间充质干细胞免疫调节机制及其相关应用的研究进展
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是成体干细胞的一种,因其具有自我更新、多向分化潜能、高可塑性、调节免疫应答、易于遗传修饰的特性[1],在细胞治疗及组织工程等领域显示出极大的应用价值.目前,MSC的常见来源有骨髓、胚胎、脂肪、脐带等.一般认为骨髓是MSC的经典来源,而人脐带来源的MSC因其易于获得,获取方法具有非侵袭性及无伦理学问题,故其相关研究进展迅速[ 2].人脐带来源MSC简单可分为脐血来源MSC (human umbilical cord blood MSCs,hUCB- MSC)和脐带MSC (human umbilical cord MSCs,hUC-MSC).hUC-MSC主要来自脐带胶质,也称华尔通胶或沃顿胶(Wharton's jelly),因此hUC-MSC亦常称为hWJ-MSC.
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人子宫内膜干细胞的分离、培养及鉴定
目的 分离、培养子宫内膜干细胞并进行鉴定.方法 采用酶消化和机械方法相结合分离人子宫内膜细胞,两次滤网过滤分离基质细胞和上皮细胞.采用有限稀释法培养基质细胞和上皮细胞,观察细胞的形态及生长特性,免疫荧光检测波形蛋白和细胞角蛋白表达情况.原代培养15 d后,计算细胞克隆形成率,流式细胞术检测抗原CD133、CD34、CD45、CD90、CD73及CD29表达.结果 基质细胞呈纤维样细胞形态,排列呈辐射状,免疫荧光显示其波形蛋白表达阳性;原代培养15 d后,细胞克隆形成率达(1.34±0.44)％.上皮细胞呈多角形或椭圆形,免疫荧光显示其细胞角蛋白表达阳性;原代培养15d后,未发现克隆形成.流式细胞术检测克隆形成的基质细胞CD29、CD90、CD73表达阳性,CD34、CD45、CD133表达阴性.结论 人体存在少量具有克隆形成能力和高度增生潜能的子宫内膜干细胞,这些干细胞也可能来源于骨髓间充质干细胞.
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成体干细胞的可塑性
继1999年和2000年连续两年被列为年度"人类十大科技进展"后,有关干细胞研究于2007年被再次列为年度十大科学突破之一.干细胞由于具有自我复制、高度增殖和多向分化潜能等特点,已经成为组织细胞发育分化研究、临床医疗应用等领域的重要材料与产品.
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大鼠胎血与骨髓非造血成体干细胞体外分化能力的比较
为了比较大鼠胎血和骨髓中非造血成体干细胞(non-hematopoietic adult stem cells, NASC)体外培养过程中的生长特性及体外诱导两者向神经元样细胞分化的异同, 在无菌条件下采集孕大鼠的胎血和成年大鼠的骨髓,用Ficoll-hypague分离液分离出单个核细胞(MNC)后,种植于含10%胎牛血清的DMEM/LG培养液内.收获的NASC传代培养,用流式细胞仪检测细胞的免疫表型.β-巯基乙醇(β-ME)、二甲亚砜(DMSO)和叔丁基对羟基茴香醚(BHA)诱导NASC向神经元分化,用免疫细胞化学染色检测其特异性标志巢蛋白(nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达.结果发现: 传代培养后的两种NASC的形态相似,皆呈均一的梭形;流式细胞仪检测结果示两种NASC的免疫表型无明显差异,表达CD44、 CD54,不表达CD11b、CD45;定向诱导的两种NASC具典型神经元形态,免疫细胞化学染色显示nestin和NSE为阳性,但GFAP为阴性.结论:大鼠胎血和骨髓非造血成体干细胞的细胞形态、生物学特性无明显差别;两者都可被诱导分化为神经元样细胞;胎血应是NASC的又一来源.
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人脐血成体干细胞体外向肝细胞的诱导分化
本研究探讨肝细胞生长因子(HGF)、干细胞生长因子(SCF)与白血病抑制因子(LIF)三者联合诱导人脐血成体干细胞(adlult stem cells,ASCs)体外分化为肝细胞的可行性,为肝组织工程提供新的种子细胞来源.采用密度梯度离心法和免疫磁珠分选系统,富集人脐血CD34+细胞进行体外诱导分化.实验分为诱导组Ⅰ:DMEM+HGF(10 ng/ml)+SCF(10 ng/ml)+LIF(10 ng//ml);诱导组Ⅱ:DMEM+SCF(10 ng/ml)+LIF(10 ng/ml);阴性对照组:DMEM.在培养第21天,用荧光倒置相差显微镜观察细胞形态;以逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫组织化学和免疫荧光分析检测白蛋白(albumin,Alb),人肝细胞型细胞角蛋白(cytokeratin-18,CK18)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)的基因和蛋白表达;用放射免疫分析法测定第7、14、21、23、25天细胞培养上清液中人Alb的含量.研究结果表明:在诱导组Ⅰ中,富集的成体干细胞出现明显的细胞形态、体积和数量变化;细胞变圆,多呈肝细胞样细胞.RT-PCR检测表明,培养第21天诱导组Ⅰ出现较强的白蛋白基因表达,AFP表达较弱,与正常肝细胞相似,诱导组Ⅱ和阴性对照组中均无表达.免疫荧光和免疫细胞化学分别检测Alb、人肝细胞型CK18显示,培养第21天诱导组Ⅰ Alb和人肝细胞型CK18呈阳性;诱导组Ⅱ和阴性对照组中均未见表达.诱导组Ⅰ细胞培养上清液中Alb含量在第21天达到峰值,第21天后明显下降,与阴性对照相比差异有显著性.结论:人脐血成体干细胞在一定的诱导条件下具有向肝细胞分化的潜能.HGF在诱导脐血成体干细胞分化成肝细胞过程中起主要作用.
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成体干细胞及其分化机理
成体干细胞是存在于胎儿和成人组织器官中具有自我更新,高度增殖和多向分化潜能的细胞,在适当的诱导条件下,可变成不同类型的细胞.成体干细胞的分化是指成体干细胞具有可在体内、体外分化成不同类型细胞的能力,将其分化物植入体内后在各种情况下都能稳定地存活.目前认为分化的可能机制是:多种成体干细胞可能在不同的器官中存在,包括出生后体内仍存在的多能性干细胞.美国Minnesota大学干细胞研究所一系列的研究证明成体骨髓中确实存在具有多分化潜能的成体干细胞,命名为MAPC,能在体外由单细胞分化为具有中胚层系、外胚层系或内胚层系特征的细胞;将其注入胚泡,能分化成各种组织细胞.多能的成体干细胞在今后能用于多个不同器官的变性或遗传性疾病的治疗.
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造血干细胞研究发展历史引发的思考
本文简要地回顾了世界干细胞研究数十年的历史经过.它的原始研究是为了解决二次大战末在日本两次核爆炸中所见的致死性造血损伤,这也说明世界干细胞研究为什么从造血干细胞开始,而且人们长期不关心非造血干细胞在体内是否存在.20世纪50-60年代一些聪明设计的动物实验有力地暗示造血干细胞在体内的存在,动物研究又证实正常骨髓可以修复已严重破坏的骨髓,于是人们开始相信骨髓移植就是造血干细胞移植.培养造血祖细胞集落的陆续发现证明造血祖细胞的存在.直至上世纪90年代,有了NOD-SCID或羊胎等体内检测造血干细胞的可靠方法之后,才划清了造血干细胞和祖细胞的界限.本文列举了许多实例,说明实验血液学和临床血液学发展的互动性,以及其它生物学和技术的进步,尤其是免疫学和分子生物学的进步,极大地推动了干细胞基础研究和临床干细胞移植的发展.比如HLA、单克隆抗体、DNA分子克隆、基因重组工程技术以及近年发展的生物信息学、基因组学、蛋白质组学、干涉RNA、干细胞工程技术等,使干细胞基础和临床研究进入了21世纪的新时代.免疫治疗、间充质干细胞和干细胞工程的发展,结合用于造血干细胞移植,使细胞治疗多元化成为本世纪发展的新动向.本文着重地介绍了干细胞研究的每一步发展都同时出现认识上的误区,以及给干细胞研究带来了挫折.一个误区的澄清常常历时20甚至40多年之久.例如造血干细胞与祖细胞的区分;造血干细胞体外扩增研究在世界各国注定的失败;移植脐血缺乏的是造血干细胞,还是祖细胞;多数白血病是否起病于造血干细胞;以造血干细胞是否是基因治疗中佳的外源基因载体;又如干细胞工程能否克隆实质脏器等等.在成体组织内存在成体干细胞是21世纪划时代的伟大发现,却也带来了误区和风波.本文重点分析了在成体干细胞发现的同时为什么会出现横向分化、去分化等缺乏科学根据的假说,以及部分同行视线混乱的根源与教训.文章指出误区的发生是由于缺乏实践和认识的片面性造成的,科学实践是检验和纠正认识片面性的唯一途径.整个干细胞研究的发展历史正是一个不断纠正认识误区的过程,也是必由之路.
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不同来源成体干细胞BMP-2基因转染并微囊化后细胞活性及分泌量观察
目的 比较不同来源成体干细胞BMP-2基因转染并微囊化后的存活情况,并检测分泌至微囊外的BMP-2蛋白数量.方法 从大鼠的骨髓、脂肪和滑膜组织内分离培养不同类型的成体干细胞:骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)和滑膜干细胞(SMSCS).利用高压静电装置制备海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)微囊,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞在微囊内的存活情况.利用含有BMP-2基因的重组腺病毒感染不同来源的成体干细胞后微囊化包裹,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测分泌到微囊外的BMP-2蛋白量.结果 包裹4周后荧光显微镜观察发现,BMSCs、ADSCs和SMSCs可在微囊内长期存活.ELISA检测发现,3种转基因细胞在微囊化后都可以持续分泌BMP-2蛋白,其中BMSCs分泌多,在第2、3、4周和其他2种细胞相比有明显差异(P < 0.01).结论 3种来源的成体干细胞都可以作为BMP-2基因给药促进骨再生研究的候选细胞,其中以骨髓来源的间充质干细胞为首选.
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组织工程材料捕获成体干细胞的影响因素研究
目的 探索体内埋植组织工程材料方法获取成体干细胞的相关影响因素.方法 BALB/c小鼠随机分为2组,分别埋植经环氧乙烷灭菌的明胶海绵与聚乳酸,在植入后第3、7、14天时分别取出材料,HE染色观察细胞捕获情况.将埋植相同质量明胶海绵的小鼠随机分为成骨蛋白-1(OP-1)组、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)组和对照组,在植入后第3、6、9、12、15天时分别取出材料,称取质量并进行细胞计数,采用流式细胞术检测第12天时分离获得的各组细胞表面CD34和干细胞抗原-1(Sca-1)的阳性表达率.另取第12天时分离获得的对照组细胞,分为OP-1组、G-CSF组和空白对照组,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性.结果 HE染色显示,明胶海绵与聚乳酸捕获的细胞数量均随时间延长而增加.各组植入的明胶海绵质量均随时间延长而减少,而捕获细胞数量均随时间延长而增加,OP-1组第9、12、15天和G-CSF组第9天时捕获细胞数量分别与对照组相比均有统计学意义(均P<0.05);OP-1组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率和双阳性表达率(分别为13.07%±0.19%、3.98%±0.15%、17.02%±0.12%)均明显高于对照组(分别为11.62%±0.44%、3.03%±0.11%、2.91%±0.14%,均P<0.05),G-CSF组细胞表面CD34、Sca-1单阳性表达率(分别为12.79%±0.39%、4.52%±0.35%)分别与对照组相比均无统计学意义,但双阳性表达率(10.21%±0.15%)与对照组相比有统计学意义(P<0.05).MTT检测结果显示,OP-1组和G-CSF组各时间点测定的吸光度值均高于空白对照组(均P<0.05).结论 通过体内埋植复合OP-1明胶海绵的方法可增加干细胞的捕获数量,为建立一种简易提取自体干细胞的新方法奠定了基础.
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间充质干细胞无异源/无血清培养基研发的现状和前景
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是广泛存在于成体骨髓、脂肪、牙髓及围产期脐血、脐带、胎盘等多种人体组织器官中，具有多向分化潜能、良好的体外扩增能力以及免疫调节功能的成体干细胞[1]，近年来在外科烧伤[2]、软组织填充[3]、终末期肝病[4]、心肌梗死[5]、糖尿病足[6]等疾病的治疗中展现出良好的安全性和有效性。2011年开始，韩国 KFDA 先后批准的全球首个治疗急性心肌梗死的自体骨髓 MSCs 药物 Hearticellgram-AMI、治疗软骨再生的脐带 MSCs 药物 Cartistem、治疗复杂性克罗恩病并发肛瘘的自体脂肪来源 MSCs 药物 Cuepistem，以及加拿大卫生部批准美国 Osiris 公司的干细胞药物 Prochymal的上市，是 MSCs 临床应用的历史性进步，为合理、合法、安全、有效地应用于多种疾病的治疗提供了新的契机。
