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肿瘤基因治疗的原理和技术
肿瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导人靶细胞,使其表达此基因而获得特定的功能,继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用,从而达到治疗之目的.
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永生化人肝细胞系的建立和生物学特性研究
目的 建立永生化人肝细胞系 (IHCL),评价其作为制备生物人工肝细胞材料的可行性.方法 利用基因转移技术对原代培养的人肝细胞转染永生化基因猴病毒 40 大 T 抗原和人端粒酶逆转录酶,建立IHCL.以噻唑蓝法测定 IHCL 细胞生长曲线:流式细胞仪分析细胞增殖周期;裸鼠皮肤和肝脏局部接种观察细胞致瘤性;RT-PCR 检测肝细胞相关基因 mRNA 表达;蛋白质印迹法检测肝功能相关蛋白的表达.应用 Cytodex 3微载体培养 IHCL,分析细胞的生长状态和细胞密度.将 IHCL 细胞分别与 5 例重症肝功能衰竭患者的血清共培养,培养前后检测血清中胆红素和尿素氮水平,评价 IHCL 的解毒功能.结果 所建立的 IHCL 具有原代肝细胞的形态,并具有较好的增殖能力,细胞已经传代超过 80 次.IHCL 细胞以 DNA 二倍体整数倍方式增殖,细胞倍增周期为 38 h.裸鼠接种 IHCL 部位均未见肿瘤生长.RT-PCR 检测显示IHCL 细胞表达α1-抗胰蛋白酶、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶、谷胺酰胺合成酶和谷胱甘肽硫转移酶的 mRNA;蛋白质印迹分析证实 IHCL 细胞表达这 4 种蛋白.IHCL细胞可以在微载体上贴附生长,细胞密度可以达到2.86×106个/ml.将 IHCL 细胞与重症肝功能衰竭患者血清共培养 12、24 和 48 h 后,血清中总胆红素由(346±94)μmol/L分别下降至(330±97)、(315±97)和(295±100)μmol/L,直接胆红素由(243±70)μmol/L,下降至(218±76)、(198±79)和(184±75)μmol/L,,24、48 h与共培养前比较差异均有统计学意义(P＜0.05);而尿素氮进行性地升高,由(6.6±0.9)μmol/L 分别升高至(9.0±0.9)、(9.9±1.1)和(12.5±1.6)μmol/L,3个时间点与共培养前比较差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 所建立的IHCL细胞系具有正常人肝细胞的基本生物学特性和主要的功能特性,具备成为生物人工肝细胞材料的可行性.
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不同来源成体干细胞BMP-2基因转染并微囊化后细胞活性及分泌量观察
目的 比较不同来源成体干细胞BMP-2基因转染并微囊化后的存活情况,并检测分泌至微囊外的BMP-2蛋白数量.方法 从大鼠的骨髓、脂肪和滑膜组织内分离培养不同类型的成体干细胞:骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脂肪干细胞(ADSCs)和滑膜干细胞(SMSCS).利用高压静电装置制备海藻酸钠一聚赖氨酸一海藻酸钠(APA)微囊,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)标记细胞在微囊内的存活情况.利用含有BMP-2基因的重组腺病毒感染不同来源的成体干细胞后微囊化包裹,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测分泌到微囊外的BMP-2蛋白量.结果 包裹4周后荧光显微镜观察发现,BMSCs、ADSCs和SMSCs可在微囊内长期存活.ELISA检测发现,3种转基因细胞在微囊化后都可以持续分泌BMP-2蛋白,其中BMSCs分泌多,在第2、3、4周和其他2种细胞相比有明显差异(P < 0.01).结论 3种来源的成体干细胞都可以作为BMP-2基因给药促进骨再生研究的候选细胞,其中以骨髓来源的间充质干细胞为首选.
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携带肝细胞生长因子基因的减毒沙门菌促血管形成的实验研究
目的：探讨携带肝细胞生长因子（HGF）基因的减毒沙门菌体外促血管形成的效应。方法构建携带 HGF基因真核表达载体的减毒沙门菌菌株（TPH），体外转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）后观察目的基因表达及其增殖活性；评价 TPH的细胞表达上清对鸡胚绒膜尿囊膜血管生成效应的刺激效应。结果构建的 TPH菌株在体外可有效转染 HUVEC并表达有活性的 HGF蛋白，6×105个 HUVEC细胞可表达160~190 ng的 HGF蛋白，和对照组相比，TPH转染组细胞表达上清可明显促进 HUVEC增殖，而且具有剂量-效应关系；TPH 转染组细胞表达上清也刺激鸡胚绒膜尿囊膜小血管生成，其血管数量（133.0±11.5）/cm2明显大于转染 TP的 HUVEC细胞上清组（83.3±5.5）/cm2和对照组（62.7±7.1）/cm2（P<0.05）。结论携带 HGF基因的减毒沙门菌可有效转染 HUVEC并促进细胞增殖，刺激小血管新生，可能在组织创面愈合中起重要作用，在胃溃疡治疗中有潜在的应用价值。
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略谈肾病研究中的基因转移技术
自1991年Koseki等[1]首先以逆转录病毒为载体,将体外转染报告基因-β半乳糖苷酶基因(lac Z基因)的胚肾种植于新生小鼠的肾包膜下,观察其在肾小球和远端肾小管上皮细胞(肾小管上皮细胞)成功表达以来,国内外已有许多作者采取不同的转基因方法和载体注入途径观察了一些报告基因对肾损伤或肾疾病发生发展过程的影响,从而为实施对肾损伤的保护或肾病的基因治疗提供了重要的理论和实验依据.
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重组腺病毒AdEGFP/hVEGF165快速构建及在骨髓移植小鼠体内的分布和表达效率
目的研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)重组腺病毒载体的快速构建及在骨髓移植后小鼠体内的分布和表达效率.方法利用细菌内质粒间同源重组法快速构建EGFP标记的重组腺病毒Ad-EGFP/hVEGF165;通过体外试验观察病毒的形态、滴度和安全性;经尾静脉注射3×108PFU的重组腺病毒给同基因骨髓移植BALB/c小鼠,在不同时间检测重组腺病毒在小鼠体内分布和hVEGF165的表达.结果通过细菌内质粒间同源重组法在短期内成功构建了复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-EGFP/hVEGF165;纯化的病毒颗粒在电镜下成分均一,滴度可达1010～1011PFU/ml.Hela细胞感染病毒后经多次传代未见细胞病变.借助于荧光显微镜在不同时期观测到小鼠心、肺、肝、脾、肾、小肠组织EGFP;RT-PCR分析和免疫组化染色显示脏器内有显著VEGF表达.各脏器未见明显毒性反应.ELISA法检测小鼠血浆中VEGF水平升高可达(866.67±97.13)pg/ml.结论本研究结果证实细菌内同源重组法构建腺病毒载体具有高效、省时、省力的特点,并成功介导了hVEGF165基因在骨髓移植小鼠体内的安全、稳定表达,为今后在骨髓移植过程中开展基因治疗奠定了基础.
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含hIL-2、mIFN-γ基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体的构建
提高基因治疗有效性和安全性的关键在于有效目的基因的选配和理想基因转移技术的建立.IL-2和IFN-γ是目前研究较多、疗效较为肯定的两个治疗用免疫基因,二者在诱导免疫时具协同作用.
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超声微泡与阳离子多聚物联合应用促进基因转染的研究进展
超声能够促发携核酸分子微泡于靶部位破裂并释放核酸分子,同时声致孔隙效应使得细胞膜通透性增加,促使外源基因进入细胞,实现安全有效的靶向基因转染,但其转染效率较低,转染质粒表达持续时间短暂.阳离子多聚物可通过凝聚带负电荷的核酸形成复合物并结合于细胞膜表面,通过细胞内吞或膜融合作用进入胞内,转染效率相对较高,但具有一定细胞毒性.超声联合微泡与阳离子多聚物结合应用能够进一步促进基因转染,并降低阳离子多聚物的细胞毒性,是一种有前景的非病毒载体联合基因转染技术.
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不同微泡浓度对NT-3基因转染神经干细胞的影响
目的 探讨低频超声下体外介导神经营养因子3(NT-3)基因转染神经干细胞的适宜超声微泡浓度.方法 体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl不同浓度(分别为10％、20％和30％)微泡和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒(1 μg/μl)混合静置30 min.将500 μl神经干细胞悬液(3×105/ml)加入微泡和质粒混合液中,固定声强1.5 W/cm2,照射时间60 s,占空比10％,用1 MHz超声探头辐照.转染后流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白表达情况,MTT法检测神经干细胞存活率.空白对照组为质粒与神经干细胞的混合物,不经超声辐照.结果 微泡浓度为10％时,细胞存活率＞80.00％,但细胞转染率只有(6.26±0.58)％;微泡浓度为30％时,细胞存活率＜40.00％,同时转染率低;而当微泡浓度为20％时,细胞存活率较高[(69.66±2.08)％],且细胞转染率高[(14.39±1.79)％].结论 在一定超声辐照参数条件下,微泡浓度20％的细胞转染率较高,且对细胞损伤较小,可作为神经干细胞基因转染的适宜条件.
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低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导pEGFP-N1基因转染体外前列腺癌细胞
目的 探讨低频超声联合微泡造影剂增强脂质体介导增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-N1)转染前列腺癌细胞的可行性,并对超声微泡浓度参数进行优化.方法 将前列腺癌PC-3细胞悬液分为空白对照组、超声组、微泡组、微泡+超声组、脂质体组、脂质体+微泡组、脂质体+超声组、脂质体+微泡+超声组,其中脂质体+微泡+超声组根据微泡体积浓度不同分为(0、10％、20％、30％、40％和50％)6个亚组.经超声辐照,24 h后用荧光显微镜观察细胞中基因表达情况,并用流式细胞仪检测转染率.结果 脂质体+微泡+超声组基因转染效率高,与其他组比较差异均有统计学意义( P均＜0.05)；在脂质体+微泡+超声亚组中,微泡浓度为20％亚组基因转染率高.结论 低频超声联合微泡能有效增强脂质体介导pEGFP-N1基因在体外前列腺癌细胞中的转染率,20％是体外基因转染前列腺癌细胞的佳微泡浓度.
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超声介导击破微泡增强型绿色荧光蛋白正常大鼠关节滑膜组织
目的 探讨超声击破微泡介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染大鼠关节滑膜组织的可行性.方法 将20只正常清洁级Wister大鼠分为4组,每组5只(10个膝关节).单纯质粒组:10 μg EGFP注射入大鼠关节腔内；超声+质粒组:EGFP注射入大鼠关节腔内,超声持续照射10 min;微泡+质粒组:300μl SonoVue与10 μg EGFP混合注射入大鼠关节腔内；超声+微泡+质粒组:将300μl SonoVue与10 μg EGFP混合后注射入大鼠关节腔内,超声持续照射10 min.3天后取出大鼠膝关节滑膜组织,直接贴在载玻片上,在荧光显微镜480 nm波长激发状态下观察EGFP转染效果.结果 单纯质粒组、超声+质粒组和微泡+质粒组的大鼠膝关节滑膜组织EGFP的荧光强度稍有增强；超声+微泡+质粒组EGFP的荧光强度明显增强.结论 超声介导微泡可以实现EGFP质粒对正常大鼠关节滑膜组织的转染.
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超声联合阳离子微泡造影剂体外增强基因转染
目的 探讨超声介导自制阳离子微泡破坏、增强基因转染的效果,并与普通脂质微泡对比,寻找一种更可靠、完善的基因载体工具.方法 采用水浴机械震荡法,加入DC-胆固醇制备阳离子微泡,观察其物理特性并检测其体外载基因能力.将微泡和质粒DNA加入人脐静脉血管内皮细胞后分为6组,观测不同微泡浓度对细胞存活率的影响,应用荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪检测基因转染率,MTT法分析细胞存活率.结果 自制阳离子微泡形态规整、分散度好,大载基因率为39.7％.超声联合阳离子微泡能够增强基因转染,与普通脂质微泡组相比差异有统计学意义；随着微泡浓度增加,细胞损伤增大.结论 采用自制阳离子微泡可在体外实现较高效率的基因转染.
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基因治疗中非病毒转移技术的研究进展
基因治疗是指将具有治疗作用的外源基因通过一定方式导入靶细胞,以纠正或替代发生功能缺陷的基因,从而达到治疗目的.随着对基因转移技术分子细胞生物学机制的深入探究,基因治疗正在各种疾病的治疗研究中发挥着越来越重要的作用[1].但目前,基因治疗领域还存在许多问题,其中缺乏安全、有效及可控的基因转染系统仍然是制约其发展的瓶颈[2].本文将就基因治疗中的非病毒转移技术综述如下.
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基因疗法能治愈糖尿病吗?
糖尿病是世界上严重的慢性非传染性疾病之一.长期的血糖异常可导致眼睛、心脏、肾脏、神经、血管等多器官组织的进行性损害,导致很高的伤残率和死亡率.什么是基因治疗?基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞,以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗目的.也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中,使外源基因制造的产物能治疗某种疾病.从广义说,基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术.
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基因重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染骨髓间充质干细胞及其表达和功能的测定
目的 用重组质粒pBudCE4.1_Cx43转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),观察缝隙连接蛋白43(connexin43,Cx43)的mRNA和蛋白的表达及细胞间隙连接通讯功能的变化.方法 用脂质体转染的方法将重组表达质粒pBudCE4.1_Cx43转染细胞;用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测Cx43mRNA表达,免疫细胞化学法检测Cx43蛋白的表达,划痕染料示踪法检测细胞间通讯功能.结果 转染Cx43基因后的细胞在形态学、生长能力等方面的特征与未转染的细胞比较没有明显变化;Cx43mRNA与蛋白的相对表达量和对照组相比差异显著(P<0.01);转染组细胞传递的荧光强度与对照组相比亦差异显著(P<0.01).结论 转染Cx43基因的BMSCs能表达有生物学活性的基因产物,改善细胞间通讯功能,能为细胞性心肌成形术提供较理想的基因工程细胞.
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内皮抑素基因转移联合电离辐射对肺腺癌移植瘤生长的影响
目的探讨内皮抑素(endostatin)基因转移联合电离辐射对肺腺癌移植瘤生长的抑制作用. 方法以逆转录病毒为载体,转导内皮抑素基因至肺腺癌A549细胞,获得含内皮抑素基因的A549/Endo细胞.20只裸鼠平均分为4组(A549 、A549/Endo、A549+辐照、A549/Endo+辐照组),A549、A549+辐照组裸鼠皮下种植A549细胞,A549/Endo、A549/Endo+辐照组裸鼠皮下种植A549/Endo细胞,建立移植瘤模型.A549、A549/Endo组裸鼠用于观察成瘤时间,并计算抑瘤率;另2组裸鼠于种植瘤细胞后第28天,用直线加速器电离辐照移植瘤体,剂量为20 Gy,3 d后重复照射20 Gy;照射后继续饲养荷瘤鼠,定期观察移植瘤体积变化.于瘤细胞移植后第42天(照射后第14天)处死荷瘤鼠,用免疫组化法测定4组裸鼠瘤体的微血管密度(MVD).结果聚合酶链测定(PCR)法证实,A549/Endo细胞基因组中整合有内皮抑素基因.裸鼠成瘤时间:A549组(7.8±1.6)d、A549/Endo组(12.2±1.7 )d ,两组比较差异有显著性(P<0.05);瘤细胞移植后42 d,移植瘤体积:A549组(927.8±269.2)mm3 、A549/Endo组(217.5±81.5)mm3,两组比较差异有显著性(P<0.01),抑瘤率为76.5% .电离辐照后第14天,移植瘤体积:A549+辐照组为(157.7±49.0)mm3,A549/Endo+辐照组为(4.6±2.9)mm3, 两组比较差异有显著性(P<0.01).裸鼠移植瘤组织MVD:A549组35.78±5.67 、A549/Endo组21.62±3.55、 A549+辐照组31.52±4.43、 A549/Endo+辐照组11.32±2.78,与A549组比较,A549/Endo组MVD明显减少(P<0.01),联合电离辐照后MVD进一步降低(P<0.01).结论逆转录病毒能有效介导内皮抑素基因转移;内皮抑素基因转移能通过抑制血管生成而抑制肺腺癌移植瘤的生长;内皮抑素基因转移联合电离辐射对肺腺癌血管形成和瘤体生长具有协同抑制作用.
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脆性组胺酸三联体基因对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响
目的研究外源性脆性组胺酸三联体(FHIT)基因在体内外对人肺腺癌A549细胞恶性表型的影响.方法用脂质体介导外源FHIT基因转染A549细胞,建立单克隆细胞系FHIT-A549和PEGFP-A549.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化方法检测外源FHIT基因在A549细胞的表达状况.采用细胞生长曲线、集落形成试验、流式细胞仪及裸鼠移植瘤试验研究外源FHIT基因对A549细胞体外增殖、凋亡、细胞周期和体内成瘤性的影响.结果 RT-PCR试验证实FHIT-A549中有FHIT mRNA表达,免疫组织化学染色显示FHIT-A549细胞FHIT蛋白表达强阳性,而A549细胞和转空载体的PEGFP-A549细胞FHIT基因和蛋白表达均阴性.FHIT-A549细胞的集落形成率为2.6%,显著低于A549细胞的50.1%和转染空载体PEGFP-A549细胞的53.6%,三者相比差异有统计学意义(P<0.01).流式细胞仪分析显示FHIT-A549细胞95.8%阻滞在G2期.FHIT-A549细胞移植瘤的瘤重为(0.04±0.03)g,显著低于A549细胞的(0.24±0.11)g和转染空载体PEGFP-A549细胞的(0.25±0.07)g,三者差异有统计学意义(P<0.01).结论 A549细胞内外源FHIT基因的转导并表达能显著抑制其恶性增殖和分裂,诱导其凋亡,调节其细胞周期、抑制成瘤性.
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人14-3-3γ基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用
目的 探讨14-3-3γ转基因疗法对帕金森病模型大鼠的治疗作用及可能机制. 方法 用携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(Ad)感染帕金森病大鼠模型纹状体后,采用免疫组化方法检测纹状体与黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达、免疫印迹技术检测Caspase 3及14-3-3γ蛋白的表达、高效液相色谱法检测纹状体DA及其代谢产物DOPAC含量变化,并对PD大鼠的旋转行为进行评分. 结果 Ad/14-3-3γ注射PD大鼠纹状体后14-3-3 γmRNA及蛋白均能过表达.Ad/14-3-3γ组黑质TH免疫反应阳性的细胞数和纹状体TH免疫反应阳性的神经纤维光密度值与正常对照侧的比值(0.47±0.12和0.61±0.14)显著高于PBS组(0.16±0.13和0.25±0.12)和LacZ组(0.15±0.09和0.27±0.11)(均P＜0.01).Ad/14-3-3 γ组注射侧大鼠纹状体区DA含量与对侧比值为0.37±0.14,显著高于PBS组(0.15±0.08,P=0.006)和LacZ组(0.19±0.11,P=0.007)；其代谢产物DOPAC含量与对侧比值Ad/14-3-3γ组(0.34±0.12)也高于对照组(PBS组为0.13±0.10,LacZ组为0.16±0.09,均P=0.00).Ad/14-3-3γ组注射侧纹状体中Caspase-3的表达与对侧相比显著降低.行为学评估结果显示Ad/14-3-3γ组大鼠平均旋转次数在第2次注射后的第1周、第2周和第6周均低于PBS组和LacZ组(均P＜0.01)；而PBS组和LacZ组相比,两组的旋转次数在上述三个时间点均差异无统计学意义(P=0.764,0.779和0.742). 结论 14-3-3γ对PD模型大鼠的多巴胺能神经元有保护作用,是PD基因治疗中非常有前景的候选基因.
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重组起搏基因质粒构建生物起搏器的实验研究
目的 研究旨在构建重组起搏基因质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并检测其在体外心房肌细胞及犬病态窦房结综合征(病窦)模型体内的表达.方法 对含mHCN2 cDNA 的PTR 载体进行转化和扩增,将所得mHCN2 基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,进行双酶切来鉴定克隆的正确性.将重组质粒用电穿孔法转染心房肌细胞,同时直接注射至犬病窦模型的窦房结区域,体表心电图监测犬窦房结功能改善情况,并通过荧光显微镜及RT-PCR检测重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2在体内外的表达.而对照组仅注射生理盐水.结果 构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2.荧光显微镜下可见转染后的心房肌细胞呈绿色荧光,其搏动频率较未转染的细胞明显增快[(180±11)次/min 与 (140±14)次/ min,P＜0.05].注射组织的冰冻切片显示绿色荧光蛋白,RT-PCR显示了mHCN2基因片段,体表心电图显示犬窦房结功能改善[(150±13)次/ min 与(105±17)次/ min,P＜0.05].而对照组始终未见到绿色荧光蛋白表达及窦房结功能改善.结论 成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并在体外心房肌细胞及犬病窦模型体内成功表达,为生物起搏的研究奠定基础.
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组织因子途径抑制物基因转移对大鼠血管平滑肌细胞凋亡的影响
目的 研究组织因子途径抑制物(TFPI)基因转移对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡的影响,探讨其抑制血管成形术后再狭窄的机制.方法 在体外培养的大鼠VSMC中分别转染含有人TFPI基因的重组腺病毒(Ad-TFPI)、含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒(Ad-LacZ)或PBS.通过RT-PCR方法检测外源TFPI基因的表达.细胞计数和MTT法测定细胞生长情况.电镜技术、流式细胞仪和TUNEL法分别检测细胞凋亡情况.结果 基因转移后3 d在VSMC中检测到TFPI mRNA的表达.细胞计数结果显示第1、3、5天各组细胞数无明显差异,而第7天Ad-TFPI组细胞数明显少于Ad-LacZ组和PBS组(P＜0.05).MTT结果显示基因转移后第1、3、5天各组细胞的吸光度值比较差异无统计学意义,而第7天Ad-TFPI组的吸光度值明显低于Ad-LacZ组(P＜0.05)和PBS组(P＜0.01).流式细胞仪检测结果显示基因转移后3、5、7 d Ad-TFPI组细胞早期凋亡结果均高于Ad-LacZ组.基因转移后3 d和7 d,Ad-TFPI组TUNEL阳性率分别为(10.82±1.57)%和(16.95±2.01)%,明显高于Ad-LacZ组(3.46±0.93)%和(5.11±1.29)%(P＜0.05).透射电镜结果显示基因转移后3、5、7 d Ad-TFPI组细胞逐渐出现体积变小、线粒体轻度肿胀、核固缩以及凋亡小体形成,而Ad-LacZ组则无明显改变.结论 TFPI基因转移能够显著诱导体外培养的大鼠VSMC发生凋亡,可能是其抑制血管成形术后再狭窄的机制之一.
