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略谈肾病研究中的基因转移技术
自1991年Koseki等[1]首先以逆转录病毒为载体,将体外转染报告基因-β半乳糖苷酶基因(lac Z基因)的胚肾种植于新生小鼠的肾包膜下,观察其在肾小球和远端肾小管上皮细胞(肾小管上皮细胞)成功表达以来,国内外已有许多作者采取不同的转基因方法和载体注入途径观察了一些报告基因对肾损伤或肾疾病发生发展过程的影响,从而为实施对肾损伤的保护或肾病的基因治疗提供了重要的理论和实验依据.
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光镜水平下Fabry病溶酶体贮积物的检测和定性
Fabry病是由于细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶遗传性缺失,导致该酶的底物,神经鞘脂类化合物的正常降解受阻, 神经鞘脂类化合物在溶酶体中贮积而导致的疾病[1,2].神经鞘脂类化合物由酰基鞘氨醇及第一碳位上的一个或多个糖残基组成.α-半乳糖苷酶是一种可水解神经鞘脂类化合物中酰基鞘氨醇三巳糖苷脂末端α-半乳糖残基的外糖苷酶,其功能缺失引起酰基鞘氨醇三巳糖苷脂在血管内皮细胞、纤维母细胞和汗腺细胞等细胞的溶酶体中堆积,从而导致皮肤和黏膜角质瘤、肢端疼痛和感觉异常、少汗、心血管及肾功能不全等多种临床表现[3].从遗传学上看,Fabry病是一种X连锁隐性遗传病,α-半乳糖苷酶基因已被定位于X染色体,Xq22区,其核苷酸序列已经明确[4,5].许多研究已证实Fabry病患者中的确存在α-半乳糖苷酶基因突变,而不同的突变类型体现了这种病的遗传异质性[3].
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Fabry病家系的α-半乳糖苷酶A基因突变研究
目的通过检测3个Fabry病家系基因突变类型明确基因诊断,并进行家系成员的基因型检测.方法通过PCR和直接测序的方法,对3个Fabry家系的先证者及部分家系成员外周血DNA进行α-半乳糖苷酶A编码GLA基因7个外显子及其相邻内含子的DNA序列检测.结果(1)先证者1的GLA基因7号外显子内1142位点发生碱基缺失(1142delG),1142位碱基G的缺失导致蛋白质翻译在390位氨基酸提前终止,该突变国内外均未见报道;(2)先证者2的GLA基因6号外显子内902位点存在1个错义突变,碱基G被A取代,导致其编码的第301位氨基酸由精氨酸变为谷氨酰胺(902G＞A,R301Q);(3)先证者3的GLA基因3号外显子内484位点存在1个错义突变,碱基T被C取代,导致其编码的第142位氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸(484T＞C,C142R).在3个家系的部分成员中进行基因检测,检出GLA突变基因携带者共6例,其中男性半合子1例,女性杂合子5例,突变类型均与相应先证者符合.100条正常X染色体对照中均未发现上述位点异常.结论本研究在3个Fabry病家系中检出3种GLA基因突变,其中1142delG为新发现的突变,并在3个家系的部分家系成员中检出男性半合子1例,女性杂合子5例.
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成年大鼠腺病毒表达载体介导Lac Z基因从腓肠肌沿坐骨神经转移至脊髓的研究
目的 探索将具有报告基因的重组腺病毒载体从下肢效应器沿其支配的脊神经转移至脊髓的途径.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(Lac Z)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入到成年Wistar大鼠的腓肠肌(病毒滴度为1.01×105 pfu/mL),分别在注射后第3天、7天、14天、21天及28天灌注固定动物,选取腓肠肌、与腰骶神经丛相连的脊髓节段以及对应的脊神经节作为观察对象,用β-半乳糖苷酶免疫组织化学反应鉴定被转染和表达蛋白质的细胞.结果 在注射腓肠肌3 d后,该肌肉内有被转染及表达产物的细胞;7 d后在脊神经节内出现被转染和表达的细胞;14 d后在脊髓白质的后索及外侧索内出现上述细胞;21～28 d后在脊髓灰质的后角、中间带及前角出现被转染和表达的细胞.结论 随注射时间推移,腺病毒表达载体可从下肢骨骼肌沿着受支配的脊神经转移到脊髓,所携带的报告基因也成功地表达产物,故这是一条具有潜在应用价值的微创性基因治疗脊髓疾病的途径.
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利用超声触发破坏微泡将靶基因传递给左室心肌
背景:超声触发破坏微泡(UTMD)方法被认为可作为特定器官的靶基因治疗手段.但是,至今仍没有应用此方法使基因成功表达的报导.本研究用于检测如下假说:内含CMV启动子的腺病毒β半乳糖苷酶基因(adcmv-βgal)的白蛋白微泡经UTMD后,adcmv-βgal能在鼠心肌细胞中表达.方法:adcmv-βgal粘附于全氟丙烷包裹的微泡上.平均微泡直径为3.0±1.2μm,浓度为1.6±0.2×109个/ml,每毫升微泡悬浮液中含有5×109个adcmv～βgal.活体试验证实微泡悬浮液中的病毒效价不受超声波频率的影响.凌智瑜译自Journal of the American College of Cardiology February 2000. 850 ～ 2冉海涛审校
