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光镜水平下Fabry病溶酶体贮积物的检测和定性
Fabry病是由于细胞溶酶体中α-半乳糖苷酶遗传性缺失,导致该酶的底物,神经鞘脂类化合物的正常降解受阻, 神经鞘脂类化合物在溶酶体中贮积而导致的疾病[1,2].神经鞘脂类化合物由酰基鞘氨醇及第一碳位上的一个或多个糖残基组成.α-半乳糖苷酶是一种可水解神经鞘脂类化合物中酰基鞘氨醇三巳糖苷脂末端α-半乳糖残基的外糖苷酶,其功能缺失引起酰基鞘氨醇三巳糖苷脂在血管内皮细胞、纤维母细胞和汗腺细胞等细胞的溶酶体中堆积,从而导致皮肤和黏膜角质瘤、肢端疼痛和感觉异常、少汗、心血管及肾功能不全等多种临床表现[3].从遗传学上看,Fabry病是一种X连锁隐性遗传病,α-半乳糖苷酶基因已被定位于X染色体,Xq22区,其核苷酸序列已经明确[4,5].许多研究已证实Fabry病患者中的确存在α-半乳糖苷酶基因突变,而不同的突变类型体现了这种病的遗传异质性[3].
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人胚胎期表皮干细胞与汗腺发生过程关系的研究
目的:探讨表皮干细胞与胚胎期汗腺发生过程中的相关性,为诱导表皮干细胞向汗腺细胞定向分化奠定基础.方法:分别取13～31周胚龄人胎儿背部全层皮肤,行常规组织学观察,并以免疫组织化学染色法(SP法),动态观察汗腺原基细胞、汗腺胚芽细胞及汗腺细胞对β1整合素与细胞角蛋白-19(K19)的表达特征.以细胞角蛋白-8(K8)免疫组化染色阳性为汗腺发生及成熟的鉴定标准.结果:不仅汗腺原基细胞、汗腺胚芽细胞表达β1整合素与K19,成熟的汗腺细胞亦有表达,并持续存在于汗腺发生全过程.K8始于14～16周在汗腺芽细胞内表达,并持续存在.结论:汗腺于胚龄14～16周开始发生,至第24周基本成熟.胚胎期汗腺发生过程中,表皮干细胞是汗腺发生的源泉.
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体外人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞表型转化的实验研究
目的:研究骨髓间充质干细胞(MSCs)向汗腺细胞分化的可行性.方法:体外分别分离培养、扩增并鉴定MSCs和汗腺细胞,将汗腺细胞置于47℃环境中1 h建立汗腺细胞体外休克模型,继续孵育3～5 d,收集上清液作为条件培养基对MSCs分化诱导,应用免疫组织化学和流式细胞仪法检测对比共培养10 d后MSCs细胞表型的改变.结果:检测MSCs表面标志CD29、CD44、CD105阳性,汗腺细胞表面标志角蛋白(CK)7、CK8、CK18、CK19、CEA阳性;MSCs诱导分化后CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性.而未诱导的MSCs没有检测到CEA、CK7、CK8和CK19染色阳性的细胞.结论:通过建立适当的体外汗腺诱导培养体系,中胚层的MSCs可以通过跨胚层分化途径转变为汗腺样细胞.
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人骨髓间充质干细胞诱导分化为汗腺样细胞过程中microRNA表达谱差异的分析
目的:利用微小RNA (microRNA)表达谱基因芯片检测新技术,寻找人骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为汗腺样细胞(SGLCs)过程中的关键microRNAs及其介导的分子信号通路.方法:通过间接培养方法诱导MSCs分化为SGLCs后,利用microRNA基因芯片检测,分析MSCs诱导前后以及MSCs、SGLC与正常成人汗腺细胞(SGCs)之间microRNA差异表达谱,筛选出其中发生极其显著改变的microRNAs,通过microRNA靶点预测软件,进一步筛选出其中直接靶向与汗腺发育、干细胞分化相关基因的microRNAs及其靶基因.结果:microRNA表达谱的差异比对结果显示,SGLCs与MSCs相比,19个microRNAs上调,49个microRNAs下调;SGCs与MSCs相比,120个microRNAs上调,59个microRNAs下调.取SGLCs与MSCs差异表达谱和SGCs与MSCs差异表达谱的交集,发现37个microRNAs在以上两个差异表达谱中均出现,其中12个microRNAs上调,25个microRNAs下调,它们可直接靶向与汗腺发育和干细胞分化相关的CEA等多个细胞因子,并参与EDA/EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等多个相关信号通路的调节.结论:通过生物信息学靶点分析,成功寻找到在MSCs分化为SGLCs的过程中,靶向汗腺发育和干细胞分化相关细胞因子和信号通路的关键microRNAs.
关键词： 骨髓间充质干细胞 汗腺细胞 microRNA表达谱 差异性分析 -
干细胞与汗腺再生的研究进展
汗腺作为人体大器官--皮肤的重要附属器,可排出机体25%的热量以保持体温的相对恒定.轻度烧伤时汗腺细胞可以其深部未受创的部分为模板完全修复受损的汗腺,而在严重创伤或烧伤的患者,其皮肤均为增生性瘢痕修复,汗腺不能再生.另外,还有很多种伴有皮肤汗腺发育和功能异常的遗传性疾病,现代医学也无法恢复其汗腺.因此,如何解决皮肤汗腺的再生问题已成为当今医学研究中的热点.
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ERK与NF-κB信号通路在汗腺发育过程中作用的研究进展
大面积深度烧伤形成的瘢痕组织往往导致患者汗腺等皮肤附属器受损或丧失,从而影响患者的生存质量.因此,汗腺重建研究具有重大的临床意义.汗腺细胞的分化、增殖和结构的形成受多种细胞外基质成分、调控因子、作用蛋白和信号通路的调控,迄今为止人们仍未能在体外建立功能完全的汗腺组织.因此,如何从汗腺发生的角度来实现汗腺的重建成为当前创伤修复研究的重要课题.研究证实胞外信号调节激酶(ERK)信号通路与核转录因子-κB(NF-κB)信号通路在汗腺发生和发育过程中具有重要作用,现就以上两条通路的研究进展综述如下.
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汗腺发生过程中细胞外基质成分的组织化学变化
由于汗腺组织的毁损,大面积深度烧伤后创面修复均无排汗功能.表皮干细胞是皮肤及其附属器发生、修复、改建的关键性源泉[1].因此,我们设想模拟汗腺的发生,通过调控表皮干细胞的分化方向而重建汗腺,可能是重建汗腺的唯一途径.细胞外基质作为一功能活性区域,与细胞的分化紧密相关[2].我们通过汗腺发生过程中几种主要细胞外基质变化规律的观察,试图探明汗腺发生与细胞外基质间的佳相关性,为诱导表皮干细胞定向分化为汗腺细胞提供依据.
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氧还蛋白过氧化物2在表皮干细胞向汗腺细胞诱导分化过程中对表型改变的影响
目的 探讨氧还蛋白过氧化物2基因在表皮干细胞向汗腺细胞分化过程中对表型改变的影响.方法 分离培养健康包皮获取表皮干细胞,分离培养健康成人皮肤获取汗腺细胞,以免疫荧光细胞化学染色鉴定.慢病毒载体介导的氧还蛋白过氧化物2基因分为过表达组、敲低表皮干细胞组及空白对照组,RT-PCR和Western Blot技术分别在基因和蛋白水平检测3组的氧还蛋白过氧化物2表达.每组分别通过Transwell板与汗腺细胞共培养,流式细胞术检测共培养前、后表皮干细胞CEA和β1整合素的表达情况.结果 表皮干细胞及汗腺细胞符合其相应特异性抗原.共培养前表皮干细胞β1整合素高表达(98.69±0.67)％,CEA几乎不表达(6.20 ±3.15)％;共培养后β1整合素表达程度:敲低组(19.30±0.53)％＜空白对照组(65.77±2.32)％＜过表达组(92.63±10.97)％;共培养后CEA表达程度:敲低组(95.43±2.36)％＞空白对照组(51.20±0.79)％＞过表达组(45.91±0.93)％.以上结果组间比较差异有统计学意义(P＜ 0.05).结论 氧还蛋白过氧化物2基因可抑制表皮干细胞向汗腺细胞分化的表型改变,并可提高保留其本身特异性抗原表达水平的能力.
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人骨髓间充质干细胞向汗腺细胞诱导培养中基因表达方式的研究
目的 通过诱导人骨髓间充质干细胞(hMSCs)向汗腺细胞(hSGCs)分化并检测经诱导后细胞的基因表达变化,探讨hMSCs的可塑性分化机制.方法 分离纯化并体外扩增hMSCs,设立对照组(DM组)和向hSGCs诱导的SG组、EGF10组和EGF20组等四组不同培养基体系,观测细胞形态学变化和采用流式细胞仪、RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征.结果 细胞在不同条件培养液中诱导培养均能存活;诱导培养2d后细胞数量开始扩增,细胞形态也由间充质干细胞的长梭状开始向hSGCs的扁平状转变,在SG组尤其明显;诱导培养1周后细胞数量扩增明显;与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度表达,并且表达了仅hSGCs才有表达的CK7蛋白.结论 hMSCs在不同介质诱导培养下可在形态学和分子水平上呈现向hSGCs横向分化的潜能,hMSCs的可塑性现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论.
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人脐带间充质干细胞生物学特性及向汗腺样细胞分化研究
目的：体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞（UC-MSCs），观察其生物学特性并研究其定向分化成汗腺样细胞的能力。方法将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小段，剥离血管后酶解，释放细胞贴壁生长，倒置显微镜观察细胞形态，绘制第3代生长曲线；流式细胞仪测定细胞表面标记（CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14和HLA-DR）；定向诱导分化后PT-PCR检测汗腺发育基因EDA及EDAR表达。结果原代人脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维样形态。体外诱导实验证实，该细胞阳性表达汗腺特异基因。结论人脐带MSCs体外可以分化成汗腺样细胞，为利用人脐带间充质干细胞修复汗腺损伤提供了可靠地理论依据和实验基础。
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人外泌汗腺的分离培养和鉴定
我们探讨了人皮肤汗腺细胞的分离及体外培养方法,观察总结了汗腺细胞体外培养的生长特征,以获得稳定生长的正常皮肤汗腺细胞,为体外研究汗腺奠定基础.
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炎夏谨防五种疾病
夏天烈日炎炎,酷暑难当,人体容易缺水.此时,一旦人体缺水,轻者可致人体内环境紊乱,重则可引发以下一些疾病,甚至危及生命,不可不防.中暑:当外界温度等于或超过机体皮肤温度时,可以反射性地引起发汗中枢及汗腺细胞的分泌活动,通过排汗带走大量体热,从而降低并保持正常的体温.此时若未能及时补充水分,体内大量蓄热,若超出了人体自身调节能力,就很容易中署.
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乳房外Paget病的超微结构观察
乳房外Paget病由Crocker于1889年首次报告[1],其组织发生至今尚无定论.光镜、电镜和免疫组化研究结果表明Paget细胞起源于多种类型的细胞,如:表皮的角质形成细胞、汗腺细胞(人汁腺或小汗腺)和潜在的恶性肿瘤[2].在此,我们报告1例乳房外Paget病并用透射电镜作超微结构观察,以期对Paget细胞的组织发生进行讨论.
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高温高湿环境对大鼠汗腺细胞的影响
目的 探讨高温高湿环境对汗腺功能的影响及其机制.方法 将14只SD大鼠通过随机化数字表法分为常温常湿组和高温高湿组,每组7只,实验组大鼠在饲养3d后进行湿热应激处理:将大鼠置于40℃、相对湿度65％的湿热仓中,2h后取出,72 h后采集标本.对照组室温放置,不做任何处理,72 h后采集标本.结果 光镜下湿热应激组汗液分泌部的上皮细胞胞质中空泡减少,且伴有汗腺细胞凋亡增多,高温高湿组的凋亡指数为(70.7±14.0)％,显著高于对照组[(58.6±11.7)％],差异有统计学意义(=2.478,P=0.021);Western blot结果显示,高温高湿组应激后M3受体的相对表达量为(1.21±0.16)％,显著高于对照组[(1.81±0.41)％,t=2.711,P=0.035];进一步检测到高温高湿组SD大鼠血清中乙酰胆碱的表达明显弱于对照组;并且高温高湿组超氧化物歧化酶(SOD)活力为(13.65±5.14) U/mg,较常温常湿组[(25.89±11.05) U/mg]显著降低(t=2.633,P=0.023).结论 高温高湿对汗腺细胞的损伤主要是由于组织抗氧化能力减退导致.
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汗腺细胞与骨髓间充质干细胞共培养过程中基因表达变化及意义
目的 建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)与人汗腺细胞(hSGCs)共同培养模式,检测融合细胞的基因表达变化,探讨hMSCs的可塑性分化机制.方法 分离纯化并体外扩增hSGCs和hMSCs;采用在47℃环境下热休克hSGCs 40min建立hMSCs与hSGCs共培养模式并观测细胞形态学变化;免疫细胞化学双染和RT-PCR等方法检测融合细胞的基因和蛋白表达特征.结果 共培养后镜下可见产生融合细胞,细胞形态发生渐变,表现为细胞体积增大,形状不规则,多核和异型核,胞核相互靠近,约占细胞总数的约10%左右.采用抗癌胚抗原(CEA)和抗BrdU免疫细胞化学双染法,检测BrdU标记的hMSCs与hSGCs共培养后的融合细胞,证实该类细胞具有两种细胞的独特的免疫特性;与汗腺发生形成密切的基因EGF和EGFR出现高丰度的表达(P＜0.05).结论 热休克共培养后hMSCs具有在形态学和分子水平上向hSGCs分化的潜能,细胞融合现象丰富了皮肤创面修复和汗腺再生理论.
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尿素通道蛋白在正常人和尿毒症患者汗腺细胞中的表达
目的 探讨尿素通道蛋白(UTs)在正常人和尿毒症患者中皮肤及汗腺细胞表达情况.方法 切取尿毒症及肾功正常者腹部皮肤及腋臭患者的大汗腺组织,采用免疫组化SP法及免疫荧光法检测汗腺组织中UTs的表达特征,定量分析UTs在尿毒症及对照组间表达的差异.结果 UTs在人皮肤基底层细胞及大、小汗腺组织中均有表达.N-UT-A1、UT-B1蛋白亚型在尿毒症组的小汗腺细胞中表达高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05),C-UT-A1蛋白亚型在两组间的表达差异不大(P＞0.05).结论 人皮肤基底层细胞、小汗腺细胞及大汗腺细胞中均表达UTs,且UTs在尿毒症患者的小汗腺中表达比正常人更高.
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表皮干细胞向汗腺细胞分化的表型改变及其通路机制研究
目的 探讨表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)诱导分化为汗腺细胞(sweat gland cells,SGCs)过程中表型的改变及其通路的调控机制.方法 取健康成人包皮,采用中性蛋白酶消化后高浓度Ⅳ型胶原黏附法分离培养获得ESCs,行β1整合素、角蛋白19 (cytokeratin 19,CK19)及p63免疫荧光染色法鉴定;取健康成人全层皮肤,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离提取汗腺组织,体外增殖培养SGCs,行CK7、CK18、CK19和癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)免疫荧光法鉴定.取第2代ESCs分为4组:A组将ESCs及SGCs两种细胞通过Ttranswell共培养系统共培养,B组通过单纯添加汗腺上清液培养ESCs,C组在A组基础上加入浓度为60 ng/mL的EGF,D组在A组基础上加入浓度为10 mmol/L的PD98059.分别通过倒置相差显微镜进行细胞形态学观察、流式细胞术检测ESCs表型阳性率及Western blot检测分化过程中的信号通路机制.结果 经细胞形态学观察及免疫荧光染色鉴定,提示培养细胞为ESCs和SGCs.倒置相差显微镜观察示,A、C、D组培养后细胞形态变化相似,9d后细胞开始出现扁平多角形结构改变;B组形态变化较慢,培养12 d后与其他3组结构相似.流式细胞术结果示,与B组比较,A组Transwell共培养系统共培养后,ESCs的β1整合素阳性率显著下调、CEA阳性率显著上调(P＜0.05);C组加入EGF可降低共培养系统中ESCs的β1整合素下调和CEA上调,D组加入PD98059可增强共培养系统中ESCs的β1整合素下调和CEA上调,A、C、D组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).Western blot检测示,4组均有较高水平细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)表达,但B组明显低于其他3组(P＜0.05);磷酸化-ERK表达A组高、C组低,各组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 处于SGCs生长环境中时,通过TransweU共培养系统共培养,ESCs可经诱导分化为SGCs,其表型发生相应改变;通过对丝裂原活化蛋白激酶/ERK通路的控制,可以调节ESCs的分化方向和程度.
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miRNA-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究
目的 探讨miRNA-203转染诱导人表皮干细胞向汗腺细胞分化的可能性及机制.方法 取包皮环切术获得的人正常包皮组织5例,采用0.25％胰蛋白酶-EDTA联合消化法分离表皮和真皮,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法纯化人表皮干细胞,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况,行β1整合素(integrin β1,ITGB1)、角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)、CK1、CK10、CK18、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)免疫细胞化学染色鉴定.通过脂质体转染将miRNA-203模拟物导入人表皮干细胞(实验组),转染对照miRNA模拟物作为对照组.免疫细胞化学染色法对转染后细胞行ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA单克隆抗体检测鉴定;实时荧光定量RT-PCR检测转染前及转染后72 h的细胞中miRNA-203、P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA mRNA相对表达量;Western blot法检测P63、ITGB1、CK19、CK1、CK10、CK18、CEA蛋白相对表达量;并对miRNA-203的mRNA表达与P63的mRNA和蛋白表达分别行Pearson相关分析.结果 转染前人表皮干细胞CK19、ITGB1阳性表达,转染后CK1、CK10、CK18、CEA阳性表达.实验组转染后细胞miRNA-203 mRNA相对表达量显著高于转染前(P＜0.05).实验组转染后细胞CK1、CK10、CK18、CEA mRNA及蛋白的相对表达量均高于转染前及对照组,而P63、CK19、ITGB1 mRNA及蛋白的相对表达量均低于转染前和对照组,比较差异均有统计学意义(P＜0.05).上述指标对照组与转染前比较差异均无统计学意义(P＞0.05).转染前后miRNA-203的mRNA表达量与P63的mRNA和蛋白相对表达量均成负相关,转染前相关系数分别为-0.91(t=3.862,P=0.042)及-0.96 (t=5.971,P=0.009);转染后相关系数分别为-0.92(t=4.283,P=0.031)及-0.95 (t=5.842,P=0.011).结论 miRNA-203能诱导人表皮干细胞分化为汗腺细胞,其作用可能是通过靶向抑制P63来实现的.
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小切口联合GX-3型多功能电离子手术仪治疗腋臭临床观察
腋臭是一种与遗传相关的疾病,多数患者有明显的家族史,研究证实产生腋臭的主要原因是大汗腺细胞和性激素分泌异常导致[1].治疗腋臭可通过激光、注射、手术等多种治疗途径,其中手术治疗为彻底.传统的手术治疗采用梭形皮肤切除法,术后瘢痕明显;当前通用的小切口根治术因范围不够,毛囊和汗腺清除不彻底,也会复发.在夏季人体容易发汗,腋臭气味加重,给患者带来极大的痛苦和心理上的压力.通过临床实践,笔者采用小切口联合电离子治疗腋臭,其手术并发症少,复发率底,效果满意.
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成人表皮干细胞和汗腺细胞的体外分离和培养
背景：人表皮干细胞和汗腺细胞的分离培养及鉴定，为探讨人表皮干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探讨体外分离培养人表皮干细胞及汗腺细胞的有效方法。方法：采集不同年龄段的泌尿外科患者术后包皮组织，充分清洗消毒后去除皮下组织，将其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片，用Ⅳ型胶原纯化、富集成人表皮干细胞，倒置相差显微镜观察细胞形态：使用免疫荧光染色对成人表皮干细胞表型进行分析；CCK-8检测细胞的增殖曲线；采用胶原酶消化法从人全层无损伤皮肤中分离提取汗腺细胞，并进行扩增和鉴定。结果：倒置相差显微镜下见分离培养的成人表皮干细胞呈卵圆形、细胞之间紧密相连，呈铺路石状，免疫荧光染色显示细胞表达CK19、β1整合素。倒置相差显微镜下见汗腺细胞呈扁平多角形，表达汗腺细胞标志细胞CK7、18、19及CEA。结论：本实验结果说明胶原酶消化法分离培养成人表皮干细胞及汗腺样细胞是可行的。
