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略谈肾病研究中的基因转移技术
自1991年Koseki等[1]首先以逆转录病毒为载体,将体外转染报告基因-β半乳糖苷酶基因(lac Z基因)的胚肾种植于新生小鼠的肾包膜下,观察其在肾小球和远端肾小管上皮细胞(肾小管上皮细胞)成功表达以来,国内外已有许多作者采取不同的转基因方法和载体注入途径观察了一些报告基因对肾损伤或肾疾病发生发展过程的影响,从而为实施对肾损伤的保护或肾病的基因治疗提供了重要的理论和实验依据.
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体外转染SV40的鼠内皮细胞生长特性的研究
体外培养的内皮细胞具有血清和生长因子的依赖性,且具有异质性,用其进行体外研究血管生成结果难以分析.本实验拟用SV40转染鼠内皮细胞,为体外研究血管生成提供稳定内皮细胞株.
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SARS-CoV N蛋白对真核细胞基因谱的影响
N蛋白位于SARS冠状病毒(SARS-CoV)颗粒的核心,是SARS-CoV的主要结构蛋白之一,它可以与病毒基因组RNA结合.目前研究表明N蛋白可以选择性激活AP-1(activator protein 1)信号转导途径;并发现在压力条件下(即缺乏生长因子时),N蛋白可以诱导COS-1细胞凋亡和肌动蛋白重组.本文研究了体外转染N蛋白真核表达载体后细胞基因转录水平的变化.通过长寡核苷酸芯片和SAM统计学处理,得到了瞬时表达N蛋白的真核细胞转录谱.N蛋白对哺乳动物细胞转录的影响可能与SARS-CoV的致病机理相关.
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PELA作为防龋基因疫苗投递系统的体外研究
为了解聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)作为防龋基因疫苗的投递系统的可行性、有效性和安全性,作者用PELA包被本室构建的防龋基因疫苗pEGFPC1-pacA,对DNA/PELA微球制备方法、微球特征以及体外转染进行了初步研究.
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含人HSP72重组腺病毒制备及其在肠上皮细胞中的表达
目的:构建并鉴定含人全长热休克蛋白72(HSP72)基因的重组腺病毒,为严重创伤后缺血缺氧损伤的防治提供基因治疗措施.方法:用同源重组方法构建含人全长HSP72目的基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-HSP72),并加以鉴定、扩增,以制取高滴度AdCMV-HSP72转染液,体外转染肠上皮细胞株IEC-6,检测目的基因表达.结果:将构建的重组腺病毒载体AdCMV-HSP72转染肠上皮细胞并表达48 h后,RT-PCR检测转染组显示特异性扩增的532bpHSP72目的基因片段.对照组(转染空腺病毒载体组)扩增结果为阴性.蛋白印迹结果显示AdCMV-HSP72转染组HSP72蛋白的表达明显增高.结论:腺病毒载体可较高效率介导HSP72在肠上皮细胞的表达.所获AdCMV-HSP72重组腺病毒可进一步用于基因治疗研究.
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细菌内同源重组法构建HBV S区和C区基因非复制型腺病毒载体及其体外表达
目的:构建表达乙肝病毒表面抗原(HB sAg)和e抗原(HBeAg)的非复制型重组腺病毒载体,并检测他能否在真核细胞中有效表达目的基因.方法:扩增乙肝病毒(HBV)前S2/S基因和前C/C基因片段,分别亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生分别携带HBV S区和C区基因的重组腺病毒载体pAd-HBs和pAd-HBe,经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-HBs和Ad-HBe;体外转染293和Vero细胞,RT-PCR和ELISA法检测目的基因的表达.结果:构建了表达HBsAg和HBeAg基因的重组腺病毒,病毒滴度可达5x1012pfu/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因.结论:成功构建表达HBsAg和HBeAg的重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础.
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血管内皮生长因子反义核酸治疗裸鼠皮下种植胰腺癌
目的:探讨抗血管生成基因转染治疗胰腺癌的可行性.方法:构建反向插入VEGF165cDNA的复制缺陷型腺病毒载体,体外转染SW1990细胞,MTT法检测重组腺病毒转染对细胞生长的影响.Northern blot和ELISA检测转染前后SW1990细胞VEGF的mRNA水平和蛋白表达.裸鼠皮下种植瘤瘤体内注射重组腺病毒,CD31染色观察反义VEGF重组腺病毒转染对裸鼠种植瘤微血管密度和肿瘤生长速度的影响.结果:重组腺病毒体外转染并不影响SW1990细胞的生长速度.Northern blot和ELISA检测在mRNA水平和蛋白水平证实反义VEGF重组腺病毒转染对体外培养的SW1990细胞内源性VEGF表达有明显的下调作用.体内实验表明反义VEGF重组腺病毒转染可减少肿瘤内微血管数量,肿瘤生长受到抑制.结论:反义VEGF165重组腺病毒可以抑制胰腺癌的血管生成和肿瘤的生长,为抗血管生成的基因治疗奠定了基础.
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丙型肝炎病毒结构基因转基因小鼠引起肝脏脂肪变
目的:建立持续表达和诱导表达型丙型肝炎病毒(HcV)结构基因(包括核心蛋白和包膜蛋白El、E2编码基因)的转基因小鼠动物模型,探讨HcV结构基因表达导致肝脏脂肪变的病理改变.方法:以含有近全长HcV cDNA的质粒为模板,通过多聚酶链反应(PcR)技术扩增HcV结构基因的DNA片段(约2.2kb),克隆到真核表达载体pcDNA4HisMas和pMT/BiP/V5-HisA中,分别构建成持续表达型表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和诱导表达型表达载体pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2.以限制性内切酶分析和目的DNA片段的核苷酸序列分析,证实构建HcV结构基因的真核表达载体正确无误.以脂质体体外转染cos-7细胞系,利用抗-HcV E2的多克隆抗体进行westem blot杂交分析,证实转染细胞中有HcV E2蛋白的表达.利用小鼠受精卵细胞核微注射方法,导入线性化表达载体的DNA,利用假孕小鼠的受精卵植入方法,建立了表达HcV结构基因的转基因小鼠模型.对于持续表达型转基因小鼠的死胎、6月龄以及硫酸铜诱导表达型的转基因小鼠模型的肝脏组织,进行HE染色和病理学特征的分析.结果:构建了持续性表达和可诱导性表达型的HcV结构基因表达载体pcDNA4HisMas-HcV core-E2和pMT/BiP/V5-HisA-HcV core-E2,体外转染cos-7细胞证实转染细胞中有HcV E2抗原的表达.对于持续表达型转基因小鼠死胎肝脏病理学特征进行分析,发现肝组织尚未分化发育完成,肝内有大量造血细胞,肝细胞空泡变性,单个核细胞聚集现象.对于持续表达HcV结构基因的6月龄转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现中央静脉区肝细胞小泡型脂肪变性,中央静脉周围细胞溶解坏死,中央静脉明显扩大,少数组织中亦见大泡型脂肪变性.对于可诱导型转基因小鼠的肝脏进行病理学分析,发现肝小叶内中央静脉周围坏死区累及5-10个小叶,周围无淋巴细胞浸润,交界区可见多数肝细胞核异常,或固化,或呈花环状,或溶解为淡蓝色无定形基质.泡浆内残留大量脂肪小泡,肝脏脂肪变与核异常有-移行过程.结论:建立了表达HCV结构基因的转基因小鼠,发现HCV结构基因的转基因小鼠肝脏有典型的脂肪变病理改变,为进一步研究HCV感染引起的慢性丙型肝炎合并脂肪变的特征和机制研究奠定了基础.
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肝靶向基因给药系统AsOR-PL+PEG-PEl的研究
目的:研制含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的肝靶向的DNA给药系统.方法:分别制备As0R-PL偶合物及PEG-PEI偶合物.然后按照不同的比例先后与报告基因DNA形成复合物,再进行Huh-7细胞的体外转染试验和静脉给药后小鼠体内的表达试验.结果:AsOR-Pt/PFG,-PEt/DNA复合物对受体阳性的Huh-7细胞具有较高的转染效率;小鼠尾静脉给药后能够在肝脏特异性表达.结论:含有靶向配基、DNA聚合亚基、溶酶体活性成分及聚乙二醇等多种组分的载体系统能将DNA选择性的投放于小鼠肝脏,显示了较好的应用前景.
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Rad基因重组腺病毒在培养乳鼠心肌细胞中的表达
目的:研究外源性Rad基因重组腺病毒在体外转染乳鼠心肌细胞后的转染效率及Rad基因的表达情况。
方法:构建Rad腺病毒载体,以不同的MOI值转染体外培养的原代乳鼠心肌细胞,通过荧光显微镜观察转染后荧光强度及转染效果,流式细胞仪检测转染率,采用RT-PCR、Western blot检测Rad基因表达情况。 -
透明质酸复合BMP-2转染的兔骨髓基质干细胞在裸鼠肌内成骨的实验研究
我们通过动物实验,对高分子量透明质酸(hyaluronic acid, HA)复合腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2基因(Adv-hBMP-2)体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs)裸鼠肌内成骨与成软骨能力进行了观察.
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人转化生长因子β1重组腺病毒体外转染羊传代椎间盘及软骨细胞的比较生物学研究
椎间盘及软骨退变的生物治疗是近年来研究的热点.转化生长因子β1(TGF-β1)重组腺病毒作为基因治疗的高效载体,几乎可以转染所有的体细胞表达目的蛋白,而达到生物治疗的目的.我们以人TGF-β1重组腺病毒载体(Ad/hTGF-β1),分别感染体外扩增的取自同一山羊个体的椎间盘及软骨细胞,对转染后的瞬时表达及二者的生物学行为进行了比较研究,为以生物学方法尤其是组织工程技术修复椎间盘退变提供依据.
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卵巢癌细胞中CD44的表达及其反义寡核苷酸抑制卵巢癌细胞黏附侵袭的实验研究
卵巢癌是我国常见的妇科恶性肿瘤之一,70%的患者确诊时已届晚期,故5年生存率极低.腹膜种植、转移是卵巢癌细胞转移的主要方式,也是卵巢癌患者致死的主要原因[1].CD44是目前研究较多的腹膜转移相关黏附分子,它主要介导细胞与细胞、细胞与基质之间的黏附,进而参与肿瘤的侵袭和转移.我们尝试以CD44反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)体外转染卵巢癌细胞系CAOV3,观察其对癌细胞黏附和侵袭能力的影响.
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壳聚糖-防龋DNA疫苗微粒的制备和体外表达研究
壳聚糖(chitosan,CS)是新开发的黏膜载体系统,具有良好的生物相容性和体内可降解性,并且安全无毒.我们将壳聚糖和防龋DNA疫苗制备成微粒,对微粒的大小、形态特征和体外转染进行了研究,探讨其作为防龋DNA疫苗黏膜递呈系统的可能.
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载基因阳离子脂质体的制备与包封率测定
目的:制备包封基因质粒的阳离子脂质体并考察其性质、测定包封率.方法:以DC-Chol和DOPE为材料,薄膜分散法制备阳离子脂质体,与可表达增强型绿色荧光蛋白的基因质粒结合并考察其转染性能,激光粒度分析仪测定阳离子脂质体和脂质复合物的粒径及Zeta电位;使用葡聚糖凝胶过滤法测定包封率,并对该法进行详细考察.结果:所制备的阳离子脂质体和脂质复合物的平均粒径分别为161.6和216.3 nm,Zeta电位分别为+22.2和+3.2 mV;基因质粒在0.1925 ~3.85 μg·mL-1浓度范围内线性良好,精密度高,与葡聚糖无吸附作用,柱回收率高,测得脂质复合物的包封率为89.94%.结论:采用该处方和工艺可成功制备质量良好、能有效转染细胞的阳离子脂质体载体,葡聚糖凝胶过滤法可准确测定其包封率,该法快速、简便、有效.
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基于间苯二甲醛构建的IPEI在滑膜细胞中的转染与毒性研究
目的:研究以间苯二甲醛(Isophthalaldehyde)作为连接剂构建的新型聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)衍生物IPEI为非病毒基因载体在治疗类风湿性关节炎(RA)中的应用,主要对阳离子聚合物IPEI在SD大鼠滑膜细胞中进行体外生物学评价.方法:IPEI以不同质量比包裹绿色荧光蛋白(GFP)质粒和白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)质粒,研究复合物在滑膜细胞中的转染活性,同时用MTT方法研究聚合物对滑膜细胞的细胞毒性.结果:复合物在质量比为2到10范围内,转染效果比较理想,具有高效输送质粒的能力;同时IPEI的细胞毒性也很小,细胞存活率明显高于商业化转染试剂PEI 25 KDa对照组.结论:阳离子聚合物IPEI具有高转染效率和低毒性的特点,从体内水平上证实了IPEI是一种良好的治疗类风湿性关节炎的基因输送载体.
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阿德福韦酯抗病毒治疗对乙型肝炎病毒核酸序列及体外转录水平的影响
阿德福韦酯(ADV)能有效抑制HBV复制,且对拉米夫定耐药株有效,是一种新型核苷类抗病毒药物,其耐药相关变异有rtN236T和A181V突变.我们采用HBV全基因组克隆及体外转染的方法,观察了4例慢性乙型肝炎(CHB)患者在使用ADV抗病毒治疗的不同时期HBV全基因组序列及HBV病毒株体外转录水平的变化.
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EGFR胞内酪氨酸激酶结构域在人肿瘤细胞中的稳定表达
目的:探讨在人肿瘤细胞中稳定表达EGFR-TKD的方法.方法:采用磷酸钙共沉淀基因转染技术,将已构建的pEF-BOS/GST-EGFR-TKD质粒DNA与pBabe-puro质粒DNA共同导入体外培养的人非小细胞肺癌细胞系H1299中.加入嘌呤霉素,对转染的细胞加压筛选,以获得成功转染的细胞.免疫荧光法对重组质粒在H1299中的表达水平及定位进行检测.结果:经嘌呤霉素筛选,8d后对照组细胞全部死亡.转染组部分细胞存活,形成单克隆集落,经多次传代培养后,荧光显微镜下观察见多数集落的细胞胞质内表达GST-EGFR-TKD.结论:通过磷酸钙共沉淀法可成功转染H1299细胞,获得稳定表达EGFR-TKD的人肿瘤细胞.
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氨氧基脂质的设计、合成及体外转染试验
为了找到一种结构简单的氨氧基辅助脂质,且能很好地适配阳离子脂质体达到高效转染目标基因的目的,本文用三缩四乙二醇、胆固醇氯甲酸酯和N-叔丁氧羰基氨氧基乙酸等经济易得的原料,合成出一种新的氨氧基脂质APCL.它是一个两端分别为氨氧基和胆固醇甲酰基,并以一条连接链连接的两亲性脂质分子.将APCL同阳离子脂质和其他辅助脂质通过薄膜分配法制成脂质体,并包裹报道基因,以另一种目前常用的氨氧基脂质CA为对照进行试验,相同条件下的体外转染数据显示,APCL阳离子脂质体运载系统比CA体系的体外转染活性更高,平均转染活性提高了3~5倍.
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HBV感染对趋化因子CCL20表达的影响及其意义(摘要)
目的研究HBV不同感染状态对CCL20表达水平的影响,探讨CCL20在乙肝病毒感染中的作用.方法通过基因体外转染技术,建立HBV不同感染状态的肝细胞模型;以内对照定量RT-PCR检测HBV不同感染状态下CCL20的表达水平.结果HBV不同感染状态下CCL20的表达水平不同,HBV未感染肝细胞CCL20表达水平每106细胞为(2.65±0.02)pg/10μL,HBV短暂感染肝细胞CCL20的表达水平每106细胞为(3.43±0.02)pg/10μL,而HBV持续感染肝细胞CCL20的表达水平每106细胞为(1.22±0.04)pg/10 μL,上述三种不同感染状态下肝细胞表达CCL20的水平差异有统计学意义,表现为HBV短暂感染肝细胞>未感染肝细胞>HBV持续性感染肝细胞(P<0.05).在HBV同一感染状态下,CCL20的表达水平与HBV感染时间、细胞的培养时间、病毒载量等因素未见显著性相关;上述细胞经乙酸肉豆蔻佛波醇(PMA)活化后,相应细胞CCL20表达均明显增加(P<0.05),但并不改变CCL20在各细胞中的表达格局.结论HBV的不同感染状态影响了CCL20的表达.