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05 乙脑病毒的减毒变异株CH2195LA的全核酸序列和细胞系增殖模型
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结核分枝杆菌核酸检测试剂生产质量控制与临床研究概述
Mtb核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而检测特定Mtb核酸序列或筛查特定Mtb基因的检测技术,常用检测技术有:PCR、连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)、转录依赖的扩增反应(transcription mediated amplification,TMA)等.笔者主要针对Mtb核酸扩增法检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制及临床研究的技术要求进行概述,为Mtb核酸扩增法检测试剂的研制提供参考.
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克里米亚-刚果出血热病毒特征核酸序列克隆载体的构建
[目的]构建含有克里米亚-刚果出血热病毒特征序列的克隆载体.[方法]设计RT-PCR引物及反应体系,从克里米亚-刚果出血热病毒RNA中扩增获得目的序列,进行分离纯化和回收,将纯化的扩增片段与pMD18-T载体进行连接,进行酶切鉴定与测序鉴定.[结果]确定检测克里米亚-刚果出血热病毒一步法RT-PCR的反应条件及体系,引物终浓度为400nmol/L,反应条件为:50℃ 30 min,94℃4 min,94℃ 30s,57℃ 30 s,72℃30 s,35cycles.成功将CCHF的特征序列片段克隆,pMD18-T载体经DNA测序鉴定正确.[结论]构建的pMD18-CCHF质粒,可用于克里米亚-刚果出血热病毒RT-PCR实验的阳性对照.
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几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用
病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一,它们极大地威胁着人类健康.目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒,随时可能严重危害人类健康安全[1-3].
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RNA介导的转录水平调控研究进展
生命的基本过程是从DNA转录成mRNA,再翻译成蛋白质发挥功能,由于蛋白质是由mRNA所编码的,因此称这些mRNA为编码RNA;相反,那些不编码蛋白质的RNA被称为非编码RNA( non-coding RNA)。长期以来,这些非编码RNA以及它们所对应的DNA被认为是垃圾或暗物质,然而研究发现,非编码RNA的比例随着生物物种进化水平的升高而升高。随着2001年人类基因组测序的完成,发现在组成人类基因组的30亿个碱基对中,仅有1.5%的核酸序列用于蛋白质编码,其余98.5%的基因组为非蛋白质编码序列,随后启动的ENCODE研究计划中发现,75%的基因组序列能够被转录成RNA,其中74%的转录产物为非编码RNA[1]。
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多重聚合酶链式反应技术及其应用
标准的聚合酶链式反应是使用一对引物扩增一个特定的核酸序列,即单一引物对的PCR.但是在具体工作中有时需要同时对多个核酸序列进行扩增分析.显然,单引物对PCR要完成这类工作,需要耗费较多的时间和金钱.1988年,Chamberlain等[1]描述了一种多重聚合酶链式反应(multiplex polymerase chain reaction, M-PCR).
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Blast-病毒物种鉴定的新方法
采集自愿献血员中56份HCV-Ab阳性血样,常规分离血清,应用RT-nPCR对HGV-NS3区进行核酸扩增,PCR扩增产物与PMD18-T载体连接,转染DH5d工程菌株,挑选白色菌落,经内套PCR验证克隆阳性者,以碱裂解法提取质粒DNA,应用荧光染料Big Dye标记、Sanger双脱氧末端终止法进行重组DNA的核酸序列测定.将测得的核酸序列,经国际互联网络输入到NCBI的GenBank数据库的局部序列相似形查询(Blast)的查询框中,借助于GenBank数据库中的资料和计算机分析程序中的BlastN软件,与数据库中所有已知的核酸序列进行序列同源性比对搜索分析.
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核苷酸衍生物相关技术在分子诊断中的应用与展望
近年来,一些人工合成的核苷酸衍生物,包括肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)、锁核酸(locked nucleic acid,LNA)、己糖醇核酸(hexitol nucleic acid,HNA)等开始在分子诊断领域中得以应用[1].与普通的核苷酸(DNA、RNA)一样,这些衍生物由A、T、C、G四种碱基组成,可通过碱基配对原则与互补的核酸序列结合.这些人工合成的核苷酸衍生物有诸多自身优势,如较高的热稳定性、酶抵抗性等.籍此,其可以明显改善普通分子生物学技术的性能特点,包括灵敏度、特异性、重复性等.譬如,利用3’端LNA修饰的引物可显著提高单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)检测的特异性,利用PNA夹止技术的抑制作用,可选择性扩增高野生背景中的少量突变[2,3].
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聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性
聚合酶链反应(PCR)技术自1983年问世以来,因其对基因或特定核酸序列在短时间内具有极大的扩增效率,已广泛应用于感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫病、法医学、动植物和考古等诊断和研究领域,并在某些方面呈现出几乎难以替代的优势.PCR用于疾病的临床诊断后,使人们对蛋白分子表型的认识,进一步深入到了遗传物质--核酸分子的探索,也使临床检验诊断学科中的临床分子诊断技术得到了飞速发展.像任何自然界的事物一样,PCR虽然有其无可比拟的优点,但也有其一定的局限性.如果在临床实际应用中,不遵循客观规则,也很容易产生非PCR技术问题所致的错误检验结果.
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核酸序列扩增早期诊断人类免疫缺陷病毒感染
人类免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的病原体, HIV的早期诊断具有非常重要的意义.目前,用于诊断HIV早期感染的方法主要有细胞培养(病毒分离)、P24抗原检测和核酸检测.适合于HIV的早期诊断[1,2].为此,我们采用核酸序列扩增对几组可能处于HIV感染早期的高危人群的86份样品进行了检测,并结合抗体检测结果进行分析,报告如下.
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简便敏感的环介导等温扩增基因诊断新技术
核酸扩增是基因诊断技术中常用的方法之一,目前核酸扩增的方法很多,如聚合酶链反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)、自主序列复制(self-sustained sequence replication ,3SR)以及链置换技术(strand displacement amplification, SDA).
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应用NucliSens Easy Q定量检测人类免疫缺陷病毒1型RNA
获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)而导致的一种致死性疾病.目前,检测HIV-1 RNA的病毒载量主要有3种方法:分枝放大技术(bDNA)、逆转录酶扩增技术(RT-PCR)和核酸序列扩增技术(NASBA).这3项技术具有很好的相关性、敏感性和准确性[1],但是这3项技术的操作较为复杂和费时,且不能实时动态对扩增过程监控.NucliSens Easy Q是一种新的检测HIV-1RNA病毒载量技术.它结合了NASBA的扩增特点和新的分子信标技术[2,3],在本项研究中,我们通过将Nuclisens Easy Q和NASBA对临床样本及其标准血清盘的检测比较,来对这种新方法进行初步评价.
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构象敏感凝胶电泳快速检测HBV准种序列异质性的方法
目的:建立一种快速检测乙型肝炎病毒(HBV)准种遗传异质性的方法并验证其敏感性和特异性.以满足研究HBV准种需要检测大量病毒序列的要求.方法:在构象敏感凝胶电泳(CSGE)检测方法的基础上,针对HBV核酸序列组成的特殊性,调整凝胶中使用的甲酰胺和乙二醇浓度并加入一定量的尿素,另外通过一次预电泳优选驱动序列.后用改进地CSGE检测已知序列的HBV C-ORF区片段克隆,并把检测结果与DNA序列分析结果进行比对,验证该方法的敏感性和特异性.结果:用改进地CSGE检测克隆的HVC C-ORF区片段获得了清楚地电泳图谱.对已知序列的HBC C-ORF区克隆片段进行检测:在34个克隆中发现了27种不同的克隆型,准种内病毒株(克隆)频率介于2.9~17.6%,克隆型之间的遗传距离介于0.2~2%.CSGE所得结果与DNA序列分析结果高度一致.结论:我们建立的CSGE具有高度的敏感性和特异性,完全可以用于检测HBV准种序列的异质性及其他相关研究
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DNA测序模板的制备和测序引物设计中的相关问题
核酸序列测定是基因研究的重要手段,本世纪60年代和70年代,科学家们一直致力于研究测定核酸序列的方法.
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HLA-DQB1、DPB1基因与1型糖尿病相关性研究
研究认为,1型糖尿病是遗传学上易感个体胰岛β细胞损害引起的自体免疫性疾病.基因标志是理论上预测T1DM的早指标.我们对52例山东汉族T1DM患者及38例对照采用基于核酸序列的分型方法(sequencing-based typing,SBT)进行HLA-DPB1基因分型,其中32例患者及23例对照测定了HLA-DQB1基因,探讨两者与T1DM遗传易感性的相关性,结果报道如下.
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原料血浆病原体核酸检测技术应用的现状与思考
病原体核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段达到筛查病原体目的的检测技术,如聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)、转录介导的扩增系统(Transcript-mediated amplification ,TMA)等.现有资料表明,采用核酸检测技术可以明显缩短血浆感染病毒阳转前的潜伏期(窗口期)的检出期限,降低血源性病毒的传播危险.目前,核酸检测技术已经在欧美国家广泛用于血液和原料血浆的病原体筛查.我国血液制品技术管理部门从2002年开始,先后进行了原料血浆核酸检测的方法学研究和超过4万份取自不同地区样本的病原体筛查,并根据国家食品药品监管机构的要求拟定了相关技术文件;同时,国内已有部分血液制品生产企业开始采用核酸检测技术进行原料血浆的病原体筛查.
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微RNA和心血管疾病的研究进展
微RNA(microRNA,miRNA)是一类长度很短的非编码蛋白质的单链小分子RNA,广泛存在于多细胞生物和病毒体内,是一种起负调控作用的分子,主要通过核酸序列互补匹配结合到特定的靶mRNA上,抑制靶mRNA翻译过程或降解靶mRNA.目前越来越多的研究结果显示,miRNA的表达及功能失调可能导致心血管疾病的发生.现将对这方面的新研究进展综述如下.
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甲型H1N1流感的流行特点及防控对策
甲型H1N1流感于2009年3月18日首先在墨西哥出现,疫情迅速蔓延,席卷全球~[1].经美国疾病预防与控制中心(CDC)鉴定,致病原为同时含入、禽和猪流感病毒核酸序列的新型甲型H1N1流感病毒~([2-4]).
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获得性免疫缺陷综合征患者抗病毒治疗后耐药基因变异分析
3例人类免疫缺陷病毒(HIV)-1阳性患者.采集血浆,设计针对HIV-1全长蛋白酶基因和部分逆转录酶基因(40-250 aa)引物,RT-PCR法扩增模板RNA,PCR产物序列测定后,用HIVdb软件进行HIV-1耐药突变相关位点的分析;流式细胞术检测患者外周血CD4+/CD8+ T淋巴细胞数,核酸序列扩增实验(NASBA)进行外周血病毒负荷的测定.所用抗HIV病毒药物包括去羟肌苷(ddI),司他夫定(d4T),双汰芝[AZT (齐多夫定)+ 3TC(拉米夫定)],奈韦拉平(NVP),施多宁(EFV)和佳息患 (IDV).
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SLE小鼠高IgG血症Fcgr2b基因序列分析
目的: 测定系统性红斑狼疮(SLE)小鼠模型-NZB/WF1双亲NZB,NZW小鼠 Fcgr2b基因启动子区核酸序列,明确Fcgr2b基因启动子区的突变性质.方法:扩增NZB,NZW小鼠Fcgr2b基因启动子DNA进行核酸序列分析.采用ELISA法测定、比较(NZB×NZW )F1×NZW回交小鼠Fcgr2b基因B/W型与W/W型组间血清总IgG 水平.结果:NZB小鼠Fcgr2b基因启动子区与正常鼠Balb/C相比存在2个部位碱基缺失,分别为13 bp及3 bp.NZW小鼠除有3个碱基置换外,与Balb/C鼠该基因启动子区序列相同.回交小鼠Fcgr2b基因B/W型组血清总 IgG水平明显高于W/W型组(P<0.0001).结论:NZB小鼠Fcgr2b基因启动子区存在碱基缺失,且该缺失突变可能与血清总IgG水平升高有关.