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基因芯片技术在乙型肝炎病毒基因分型检测中的应用探讨
目的:探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.方法:查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术,通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比,探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.结果:HBV的基因分型,既可通过全基因序列比对,也可通过片段基因序列比对,片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法,现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点,技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道.结论:借鉴现有的PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法,如微板核酸杂交-ELISA显色技术,理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的,并且具有高效、快速和廉价等特点.
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应用微孔噬菌体扩增法检测结核分支杆菌利福平的敏感性研究
目的:评价应用微孔噬菌体扩增法快速检测临床结核分支杆菌分离株的利福平敏感性.
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噬菌体扩增法快速筛选结核分支杆菌对抗结核药物敏感性的研究
目的:利用噬菌体扩增技术对结核分支杆菌临床分离株进行异烟肼和氧氟沙星药物敏感性分析,评价该表型鉴定法的应用价值.
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结核分枝杆菌核酸检测试剂生产质量控制与临床研究概述
Mtb核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段,从而检测特定Mtb核酸序列或筛查特定Mtb基因的检测技术,常用检测技术有:PCR、连接酶链反应(ligase chain reaction,LCR)、转录依赖的扩增反应(transcription mediated amplification,TMA)等.笔者主要针对Mtb核酸扩增法检测试剂的主要原材料、生产工艺及反应体系、产品质量控制及临床研究的技术要求进行概述,为Mtb核酸扩增法检测试剂的研制提供参考.
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耐消毒剂基因检测real time PCR方法的建立和评价
目的 建立一种耐消毒剂基因检测方法,并对其实际应用效果进行评价.方法 采用基因扩增方法,以qacC基因序列合成一条MGB探针,并对其特异性和灵敏度进行评价.结果 用本研究建立的real time PCR方法对64株临床分离的金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因进行检测证明,qacC基因携带率为15.6%.所合成的qacC探针对qacC基因扩增良好,对qacA/B等其他基因无扩增,检测下限为10拷贝.结论 本研究所建立的real time PCR方法对qacC基因检测具有灵敏、特异性、通量高、耗时短,具有实用价值.
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应用不接触分离技术防止结直肠癌手术中癌细胞门静脉播散的临床研究
我们应用突变等位基因特异性扩增法(MASA)[1],对不接触分离技术和传统手术门静脉血中癌细胞的播散情况进行前瞻性对照研究,以期从基因水平评估不接触分离技术对结直肠癌手术中癌细胞门静脉播散的影响及其应用价值.
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环介导等温扩增法在食物中毒快速检测中的应用
根据广东省卫生厅对2005年全省食物中毒疫情统计显示:由病原微生物引起的食物中毒占全部食物中毒疫情的30%以上,由细菌引起的食物中毒多发生在学校、工厂等单位的集体食堂,由此引起的中毒人数众多,社会影响巨大;特别是由病毒(轮状病毒、诺瓦克病毒)引起的食物中毒除发生在成人外,还特别容易在托幼机构、幼儿园流行.针对由病原微生物引起的食物中毒能否及时准确检测出相关病原体,成为预防和控制食物中毒的关键措施.因此,对食物中毒的快速检测特别是现场检测是摆在各级卫生系统和科研工作者面前的一项重要任务.
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食源沙门菌DNA环介导恒温核酸扩增法检测
沙门菌是食源性致病菌中一个主要的属,在各类细菌性食物中毒事件中,沙门菌造成的食物中毒位居前列[1.2].常规的沙门菌检测方法费时费力,已经不能满足食品生产质量控制的要求[3].因此,需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法.Notomi等开发出一种新的恒温核酸扩增法一环介导恒温核酸扩增法(loop-mediated isothermal amplification ofDNA,LAMP)[4,5].本研究利用DNA环介导恒温核酸扩增法对市售不同生肉来源的沙门菌进行快速检测,并且着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行验证,以建立的IAMP反应条件能够对今后病原微生物的检测研究工作提供参考依据.
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斑疹伤寒型别鉴定的研究
斑疹伤寒包括流行性斑疹伤寒和地方性斑疹伤寒两个病种,分型报告疫情是非常必要的.目前采用能够分型的微量补体结合试验作为实验室诊断的方法,但由于抗原高度交叉,只能以同源高于异源的血清效价来分型,但不能分型者为数不少.本文是在分析莫氏、普氏立克次体核苷酸序列的基础上,选择具有特异性的序列合成引物,通过PCR扩增法[1]对2种斑疹伤寒立克次体进行鉴别诊断,达到分型的目的.现报告如下.
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噬菌体扩增法与BACT/ALERT3D法检测分枝杆菌的应用比较
目前结核病仍是严重威胁人类健康的重大传染病,其实验室快速诊断一直是国内外研究的对象.因而,迫切需要一种快速、简便、灵敏、廉价的方法应用于临床标本的检测[1,2].
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头孢西丁纸片扩散法检测耐甲氧西林葡萄球菌的评价
目前在临床实验室常规开展的检测MRS的方法如苯唑西林K-B法、E-test微量稀释法、琼脂筛查法等表型试验,因不同的MRS具有不同的耐药水平(MIC不同),而无法检测处于临界范围的MRS,特别是低表达的MRS.在2002年,美国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)指出,一旦葡萄球菌检出mecA基因或PBP2a蛋白即可定为MRS,因此PCR扩增法检测MRS的mecA基因是判断MRS的金标准,但是该方法对于实验室设备要求、操作人员的要求十分高,而且费用昂贵,不易在临床实验室中常规开展.而头孢西丁纸片扩散法操作简单、准确率高、同PCR扩增法的结果具有很好的相关性,可以在临床实验室常规开展,是目前临床实验室筛选MRS好的表型试验之一.
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一步聚合酶链反应法快速鉴定并区分巴通体种
鉴于巴通体分离培养的困难及血清学方法敏感性和特异性不高,前人已经建立了其他的检测方法,包括多步聚合酶链反应(PCR)扩增法、PCR-RFLP、PCR-序列分析等,但其操作步骤均较繁琐、复杂.本文作者建立了一步PCR法用于与医学相关的巴通体6个种的鉴定.
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胆汁端粒酶活性检测对消化道恶性肿瘤的诊断意义
自1994年Kin等[1]报道了端粒酶重复诊断扩增法(TRAP)以来,国内外对各种恶性肿瘤组织细胞端粒酶的研究报道骤增,但以体液进行端粒酶研究的报道相对较少,尤其对部分恶性肿瘤患者取胆汁标本进行端粒酶活性检测报道更少.由此,我们对部分外科住院患者取胆汁标本(引流或穿刺)进行TRAP法端粒酶检测,现将结果报道如下.
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LAMP(环介导等温扩增)的原理及在寄生虫检测上的应用
2000年,Notomi等[1]建立了一种快速、简单、灵敏、特异并且低成本的核酸扩增方法——环介导等温扩增法(LAMP),这种新颖的核酸扩增方法具有许多优势[2.4]:(1)扩增效率极高,60min内扩增产物可达到靶基因的109~1010倍;(2)操作简单,只需在65℃左右的恒温条件下将反应物混合即可,不需要复杂的温度变化过程;(3)灵敏性高,扩增模板只需10拷贝或更少;(4)特异性高,设计4条引物识别靶基因上6个不同区域;(5)结果判定简单,可以通过反应副产物直接肉眼观察,也可以通过浊度仪实时监控,无需电泳.
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二例血涂片检出真菌的报告
由于临床上真菌的感染不断增多,因此真菌的检出对疾病的诊断和治疗具有重要的作用.目前发现真菌的感染既可以发生在局部,也可以发生在全身,所以临床上可通过直接镜检法、培养法、核酸扩增法、免疫法发现或诊断真菌感染,其中直接镜检法因简单、方便、快捷和行之有效,常被采用.现将我科在2004年通过血液涂片发现的二例真菌感染的病例报告如下,以供大家参考.
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特异扩增法检测大肠癌淋巴结微转移突变等位基因的研究
我们设计用K-ras基因第一外显子(12/13密码子)和结肠腺瘤性息肉(APC)基因突变聚集区(MCR)引物,采用多基因聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和突变等位基因特异扩增(MASA)法对60例大肠癌的癌组织及突变病例所属常规病理检查转移阴性的淋巴结进行联合检测,探讨癌基因检测淋巴结微转移的途径及意义,并经DNA序列分析证明了此方法学的可靠性.
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TTVDNA在肝细胞中的表达及其致病性研究
1997年12月日本学者Nishizawa等先从一例输血后非甲非庚型肝炎患者血清中分离到一种DNA病毒克隆(N22),命名为TT病毒(transfusion transmitted virus,TTV).并报道感染TTV后表现为一过性或持续性病毒血症,且病毒滴度与ALT升高相关,推测TTV可能是未知病毒致肝损害的病因之一[1].为探讨这一新型病毒在肝组织中的表达与分布特点,我们在TTV ORFl的保守区设计一对引物,采用PCR扩增法,以地高辛标记TTVORFl部分基因序列(1914-2186nt),获得双链TTV DNA探针.用此探针对部分肝病患者肝组织TTV DNA进行原位杂交检测,并对其中一株TTV ORFl部分基因进行分子克隆与核苷酸序列分析,现报道如下.
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环介导等温扩增技术的应用和发展
扩增是生命科学领域的常用研究工具,20世纪80年代出现的聚合酶链反应(PCR)得到了广泛的应用,但该方法需要特殊的仪器、模板的热变性及长时间的温度循环.20世纪90年代出现了几种核酸等温扩增方法:核酸等温扩增法、自序列复制法和链置换扩增法等,它们或者需要精密的仪器,或者在产物检测方面相当繁琐,或者特异性不高等[1-2],均限制了其广泛应用.
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核酸序列依赖性扩增技术(NASBA)概述
随着分子牛物学技术的快速发展,体外核酸扩增技术己逐步应用于科研和临床.近几年才兴起的核酸序列依赖性扩增法(Nuleic and sequerce based amplipicain,NASBA)同传统的实验方法相比有灵敏性高,特异性强,快速,高通量等优点,而倍受中外学者的青睐.本文就NASBA方法作一综述.
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结核分枝杆菌耐利福平诊断试验的系统评价
目的 采用Meta分析的方法评价LiPA和phage-based assays法检测结核分枝杆菌耐利福平诊断试验的准确性.方法 通过检索PubMed、EMbase、CBMWeb、CSJD、CJFD数据库和其他方式广泛收集文献.根据QUADAS质量评价标准评价纳入文献的质量,用Meta-Disc软件对其敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比等进行合并分析,并进行异质性检验,对无异质性的研究绘制SROC曲线.结果 终纳入42篇文献.(1)LiPA法检测结核分支杆菌耐利福平时,7个研究以BACTEC 460法为参考,合并敏感度0.98,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.992 4;6个研究以proportion法为参考,合并敏感度0.97,合并特异度1.00,SROC(AUC)=0.9961;3个研究以BACTEC 460、Proportion法作为参考,合并敏感度0.92,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9842;(2)噬菌体扩增法(商用)检测结核分枝杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC 460、Proportion法为参考,合并敏感度0.95,合并特异度0.95,SROC(AUC)=0.9842,(3)噬菌体扩增法(内部的)检测结核分支杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC460、比例法、绝对浓度法和电阻率法为参考,其合并敏感度0.98,合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9949;(4)荧光素酶噬菌体报告技术检测结核分枝杆菌耐利福平的7个研究,以BACTEC 460、比例法、绝对浓度法为参考,其合并敏感度0.98.合并特异度0.98,SROC(AUC)=0.9788.结论 现有研究证实:(1)采用分离培养时,噬菌体检测法在检测结核分枝杆菌耐利福平方面具有较高的敏感度和特异度,在提高耐多药结核病诊断准确性方面具有潜力.(2)LiPA在检测结核分枝杆菌耐利福平方面也具有较高的敏感度和特异度,但直接应用临床标本检测时敏感度似乎稍有下降.上述结果尚需更多设计严谨、科学的临床试验进一步证实.